隨著人們環境保護意識的提高，污水排放標準也在不斷完善。活性污泥微生物在污水處理過程中凈化水體，消除污染物等方面作用突出，因此通過研究活性污泥微生物的區系組成及群落結構的演替，找到運行時的優勢菌種已成為水處理研究領域的熱點[1]。而有機物-污泥負荷(Ns)在微生物生長動力學及活性污泥動力學的研究中具有重要意義。Ns反映了活性污泥污水處理過程的能量水平，直接影響了微生物的生長模式[2]。當Ns發生變化時，在短時間內微生物群落結構及污水處理效果都會發生明顯變化[3]。因此有Ns作為活性污泥處理系統設計?運行最基本的參數之一，具有很高的工程應用價值[4]。
PCR-DGGE技術可直接從樣品中提取細菌的DNA或RNA來表征微生物種群，克服了傳統微生物群落結構分析方法的不足[5，6]，并且能夠檢測識別出不可培養的細菌，對細菌生態學的發展起到了巨大的推動作用[7]，已經成為對微生物群落結構進行多樣性分析的主要生物學方法[8]。根據實驗所測得的不同污泥負荷沖擊條件下微生物群落結構和優勢菌種來調節工藝運行參數，這對優化活性污泥系統運行?提高污水處理效果等都具有十分重要的實際應用價值和理論探索意義。
為了進一步研究Ns對活性污泥微生物的影響。實驗以碳源作為限制條件，以某高校MBR內的污泥作為種泥，以SBR作為小試處理工藝，以某高校游泳館污水為處理對象，綜合運用PCR-DGGE技術，試討論在不同Ns條件下活性污泥中氨氧化菌群落結構的演替及其多樣性的變化情況，以期進一步了解Ns與活性污泥微生物群落結構和生物多樣性的內在聯系。
1 材料與方法
1：1 實驗裝置與運行條件
實驗采用自行設計如圖1所示的間歇進水序批式反應器(SBR)，反應器的主體以有機玻璃制成，長112mm?寬106 mm?高500 mm，設計水面高度400mm，其有效容積為4L。反應器中間采用有機玻璃隔板，隔板的上端距水面為約為50mm，下端為高度40mm左右的過水通道。采用隔板將反應器主體分割成體積比為6∶4的曝氣區和非曝氣區。非曝氣區通過設置可控溫度加熱器維持水溫恒定。在曝氣區內采用微孔曝氣，為微生物生長提供所需的溶解氧，同時達到泥水混合的效果。
? 實驗以某高校MBR反應池內活性污泥作為接種污泥，培養馴化25d使其恢復活性并具有良好的沉降性。
實驗用水為某高校游泳館的污水和投加的葡萄糖。通過投加葡萄糖來調整進水有機物濃度以達到預期的實驗要求。通過反應器的進水有機物濃度與曝氣?沉淀?排水的時間來對污泥負荷進行調整。污泥負荷沖擊采用超負荷法[9]，即對每一負荷階段，當反應器系統運行穩定并取樣分析之后，提高污泥負荷進行下一次沖擊。傳統活性污泥法系統設計的典型Ns為0：2~0：5kgBOD5/(kgMLSS·d);具有脫氮功能時一般選擇較低的Ns為0：05~0：15kgBOD5/(kgMLSS·d);延時曝氣氧化溝處理系統的Ns更低為0：03~0：08kgBOD5/(kgMLSS·d)，高負荷活性污泥法Ns為1：5~3kgBOD5/(kgMLSS·d)[10]，因此本實驗將污泥負荷階段分為三大階段，共7個污泥負荷沖擊過程進行，各沖擊負荷階段的運行參數見表1。污泥負荷沖擊2d后立刻取樣，用于后續PCR-DGGE分析。
1：2 污泥樣品基因組DNA的提取與純化
1：2：1 樣品預處理
將8mL污泥混合液加入至10mL滅菌離心管中，在3000×g下離心4min，棄去上清液。用滅菌蒸餾水清洗一次，同樣的條件下離心4min，棄去上清液。得到的污泥樣品可用于DNA的提取。
1：2：2 基因組DNA的提取
基因組DNA的提取采用化學裂解-酚氯仿異戊醇抽提-試劑盒純化的方法，具體步驟見參考文獻[9]。
1：3 氨氧化菌的NestedPCR擴增
氨氧化菌的NestedPCR擴增技術需經過2輪的PCR擴增，第1輪以總DNA為模板使用氨氧化菌的特定目標引物和相應的PCR反應程序對氨氧化菌進行針對性擴增;第2輪以第1輪PCR擴增產物為模板用通用引物F357-GC和R518與PCR反應程序進行擴增。氨氧化菌的特異性引物對為上游引物是將CTO189fA/B與CTO189fC以2∶1的摩爾比混合，下游引物為CTO654r[11]。第1輪PCR反應體系為25μL的2×TaqPCRMasterMix，1μL的上游引物，1μL的下游引物，1μL的模板，然后用無菌超純水補足至50μL。第1輪PCR反應體系同上，同時做空白對照。
擴增后PCR產物經瓊脂糖電泳檢測片段大小約為250bp，表明PCR擴增成功，可進行后續DGGE電泳分析。
1：4 氨氧化菌16SrDNA片段的DGGE分析
實驗采用C：B：S： SCIENTIFIC 公司DGGE-2001系統對PCR產物進行變性梯度凝膠電泳分離，完畢后將凝膠進行硝酸銀染色，碳酸鈉顯影，并將圖像在觀測儀中進行拍照存檔。
1：5 目的條帶的克隆與測序
選取DGGE上明顯的條帶用滅菌刀切取并置于1：5mL的滅菌離心管中，加入50μL已滅菌的超純水，在60~100℃下水浴20min;取出離心管置于4℃冰箱中靜置過夜，待DNA片段從膠中緩慢浸出。將離心管在5000r/min下離心5min，取6μL浸出液為模板進行PCR擴增。
將PCR擴增產物置于1：5% 瓊脂糖凝膠中檢測，若電泳結果較好，則將PCR產物送至天津華大基因技術有限公司進行DNA常規測序。
1：6 DGGE圖譜的生物多樣性及相似性分析
通過應用Bio-Rad公司的凝膠分析軟件Quanti-tyOne(4：26版)對掃描所得DGGE圖譜中氨氧化菌條帶的強度進行分析，將每個條帶的強度轉化為峰面積值輸出，并采用Shannon-Wiener多樣性指數計算公式進行計算。對微生物群落內微生物菌種的多樣性進行評價。利用戴斯系數(Cs)討論氨氧化菌群的相似性。同時根據DGGE條帶分布的相似程度構建標準泳道比較圖和族群歸屬系統樹狀圖。具體參見污水技術資料更多相關技術文檔。
多樣性指數H計算公式為:
? 式中:Pi=ni/N，其中ni為條帶i的峰面積，N為所有峰的總面積。
戴斯系數計算公式為:
?
式中:j為泳道A和B共有條帶，a和b分別為樣品A和B中各自的條帶數。
