1 引言

　　微生物燃料電池(Microbial fuel cell，MFC)能在降解有機污染物的同時產生電能，是一種新概念的廢水處理方法(Logan et al., 2006a;2009).其原理為：陽極微生物厭氧氧化有機物獲取電子，并將電子傳遞給陽極，再通過外電路傳遞給陰極電子受體(如氧氣)，同時伴隨著質子由陽極到陰極的跨膜擴散(Logan et al., 2006b).

　　陽極微生物是影響MFC產電和降解性能的關鍵因素(Logan et al., 2008).宋天順等(2012)以氨氮模擬廢水為底物，分別以厭氧污泥和河底沉積物接種單室MFC陽極，研究發現，厭氧污泥接種的MFC的最大功率密度比沉積物接種的MFC大46.8%，但氨氮去除率卻低3.8%.王慧勇等(2012)以模擬淀粉廢水為底物，比較了分別接種生活污水和淀粉廢水的MFC的性能，發現接種生活污水的MFC的最大功率密度比接種淀粉廢水的高141.3%，氨氮去除率高2.7%. Li等(2013)以廚余浸出液為底物，發現以厭氧污泥為接種源的MFC的最大功率密度比以生活污水為接種源的MFC低1.8%，但VFA去除率高5.5%;PCR-DGGE分析發現二者的優勢菌種存在顯著差異.可見，在相同的MFC構型和環境條件下，接種源的微生物多樣性與基質的特異性決定了MFC陽極微生物種群結構(Logan et al., 2006b;Pham et al., 2009)，從而可能影響了MFC的產電和降解性能(Aelterman et al., 2006).

　　理論上，在易降解有機物-難降解有機物共基質體系中可馴化出能適應難降解有機物的菌種，基質的選擇性壓力(Logan et al., 2006b)會改變MFC陽極最初的微生物群落結構，富集出適應于代謝基質的優勢菌群(Logan，2009; Yang et al., 2012).因此，在課題組前期研究的基礎上(Sun et al., 2009a;2009b;Cao et al., 2010;Hou et al., 2011;Sun et al., 2011;2012)，為明確接種源對MFC同步降解剛果紅和產電的影響規律，本研究以葡萄糖-剛果紅為共基質，以印染廢水和生活污水處理系統中的污泥為接種源，探究兩種接種源MFC同步降解剛果紅和產電性能情況;并通過分析陽極生物膜電化學特性，分離并鑒定穩定運行下的MFC陽極優勢菌種，闡明兩種接種源MFC陽極優勢菌種差異與降解剛果紅和產電性能之間的關系，為基于接種源調控的MFC降解難降解有機物和產電提供借鑒.

　　2 材料與方法

　　2.1 試劑

　　剛果紅(C32H22N6O6S2Na2，分析純)，購于天津大茂化學試劑廠，使用前未經純化處理.

　　2.2 反應器及其接種與運行

　　采用好氧生物陰極雙室MFC反應器(Hou et al., 2012)，取廣州市獵德污水處理廠和新洲工業園某印染廢水處理站的厭氧污泥各10 mL，混合后分別作為MFC-M和MFC-I(M、I分別為Municipal、Industrial的縮寫)陽極的接種源，接種濃度為2.0 g · L-1(以MLSS計).從馴化到穩定運行階段，兩個反應器陽極室培養液的組成均保持一致：剛果紅300 mg · L-1、葡萄糖200 mg · L-1、PBS 50 mmol · L-1、微量元素溶液12.5 mL · L-1、維生素溶液12.5 mL · L-1(Lovley et al., 1988).陰極室培養液中不含剛果紅和葡萄糖，其他成分與陽極培養液相同.運行過程中，陰極室維持60 mL · min-1的曝氣量.采用批式運行，當輸出電壓值低于50 mV時更換培養液.

　　2.3 電化學性能表征

　　電化學性能表征包括輸出電壓、庫倫效率、功率密度、陰陽極極化曲線、循環伏安和電化學阻抗譜.MFC的輸出電壓由數據采集系統(Model 2700，Keithly Instruments，USA)每10 min自動采集1次.功率密度和陰陽極極化曲線采用變電阻的方法在MFC經過數周期運行穩定后進行同步測試，電極電勢測定所用參比電極為飽和甘汞電極(SCE，0.242 V vs. 標準氫電極，上海雷磁).單位面積電流密度、功率密度及庫倫效率的計算公式(Logan et al., 2006a)如下：

　　式中，I為單位面積電流密度(mA · cm-2)，U為外電路電壓(V)，R為電阻(Ω)，A為電極面積(cm2)，P為單位面積功率密度(mW · m-2)，F為法拉第常數(C · mol-1)，VAn為陽極室液體體積(cm3)，tb為周期時間(s)，ΔCOD為周期初與周期末的COD變化值(mg · L-1)，CE為庫倫效率.

　　循環伏安(CV)和電化學阻抗譜(EIS)的測定均在Princeton 2273型電化學工作站上進行.當MFC開路電壓達到穩定時，采用三電極體系進行測試，其中，工作電極為陽極，對電極為陰極，參比電極為飽和甘汞電極.循環伏安設置測試參數：掃描范圍為-0.7~1.2 V，掃描速率為10 mV · s-1.電化學阻抗譜設置測試參數：頻率范圍為100 kHz~5 mHz，交流電壓振幅為10 mV.

　　2.4 剛果紅脫色性能表征

　　剛果紅(初始濃度300 mg · L-1)脫色率由紫外可見光分光光度計(DR5000，HACH，USA)在其最大波長(496 nm)下測定吸光度的減少值計算得到.在48 h內每隔6 h從MFC陽極中取樣，稀釋后測定吸光度.脫色率η可由下式計算得到：

　　式中，A為初始吸光度，B為測試樣品吸光度.

　　脫色速率可由脫色率-時間曲線推算得出，由于脫色率隨時間增加會先呈現線性上升，在一定時間后脫色速率明顯降低、脫色率趨于穩定，為簡化計算，平均脫色速率將直接采用近似線性部分的斜率進行計算，具體公式為

　　式中，S為脫色速率(mg · L-1 · h-1)，C0為剛果紅初始濃度(mg · L-1)，t為線性部分終點時間，η為該時間點對應的脫色率.

　　采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS，6890 N/5973 inert，Agilent Technologies，USA)對MFC周期末的陽極室降解液進行產物分析.樣品處理及分析條件參考文獻(廖梅東等，2010).

　　2.5 優勢菌種的分離、純化與鑒定

　　采用營養瓊脂培養基(Nutrient agar，NA)(pH=7.0)作為純菌分離、純化的基礎培養基.在厭氧培養箱中，從穩定運行6個月以上的MFC-I和MFC-M的陽極生物膜上刮下少許，用無菌去離子水稀釋到10-6倍后涂布平板，在(30±1)℃下的NA培養基中培養48 h.用新鮮的無菌NA培養基進行重復轉移和純化，直到獲得純培養菌株.采用LB(Luria-Bertani)培養基(pH=7.0)作為富集純培養菌株的基礎培養基.所用培養基均通過多次抽真空和通氮氣以確保去除其中的氧氣.菌種委托寶生物工程(大連)有限公司采用16S rRNA基因序列進行鑒定，使用BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit在ABI-PRISMTM 3730XL DNA測序儀上進行分析，在NCBI上的BLAST-n進行比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析核苷酸序列.

　　3 結果與討論

　　3.1 兩種接種源MFC的啟動特點

　　在外接1000 Ω電阻的條件下，兩種接種源接種的MFC的輸出電壓隨時間的變化如圖 1所示.在接種后約800 h內(啟動階段)，MFC-I和MFC-M的輸出電壓均表現出波動上升趨勢，但MFC-I的輸出電壓略高于MFC-M.進入穩定運行階段后，MFC-I和MFC-M的輸出電壓差別不大.

　　導致兩種接種源MFC啟動初期電壓差別的原因在于剛果紅對微生物的選擇性壓力.印染廢水污泥中微生物長期經染料馴化，對剛果紅的適應性強，來自剛果紅的選擇性壓力較小;而生活污水污泥中的微生物首次接觸剛果紅，對剛果紅的適應性較差，來自剛果紅的選擇性壓力較大.但經過一定時間的馴化后，生活污水污泥中的微生物對剛果紅的適應性增強，剛果紅的選擇性壓力減弱，從而使兩種接種源MFC穩定運行時的輸出電壓相當.

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圖 1 兩種接種源MFC輸出電壓-時間曲線

　　3.2 兩種接種源MFC的產電性能

　　特定外電阻下的輸出電壓-時間曲線并不足以從整體描述MFC的產電性能.為探究不同外電阻下MFC-I和MFC-M產電性能的差異，采用變電阻法測試了兩個反應器的功率密度和極化曲線.如圖 2a所示，穩定運行階段MFC-M的最大功率密度達到29.09 mW · m-2，比MFC-I高出2.11倍.陰、陽極極化曲線測定結果表明，二者功率密度差異是由陽極導致(圖 2b).MFC-I陽極開路電勢較MFC-M的高，且隨著電流密度從0增加到0.015 mA · cm-2，MFC-I陽極電勢較MFC-M的抬升幅度更高，表明在相同電流密度下，以印染廢水污泥接種的MFC-I對剛果紅-葡萄糖共基質的生物電化學氧化需要更大的驅動力(即能量需求更大)，陽極過電勢越大，這與功率密度測定的結果一致.選擇運行1400 h后的3個穩定周期進行庫倫效率的測定與計算，結果表明，MFC-M的庫倫效率(即電子的回收率)較高，達31.89%;而MFC-I的庫倫效率較低，為29.03%.

圖 2 穩定運行階段MFC-I和MFC-M的功率密度(a)與陰、陽極極化曲線(b)

　　生活污水污泥接種的MFC-M產電性能更好，主要原因在于生活污水成分復雜，其污泥中微生物多樣性豐富，包含的產電菌較多(Logan，2009;Yang et al., 2012);而印染廢水污泥在染料的長期馴化下微生物種群相對單一，染料降解菌較多.此外，剛果紅的降解與產電是電子競爭過程，相對于陽極，剛果紅優先獲得電子(Sun et al., 2012)，MFC-I中較多的染料降解菌能競爭到更多的電子用于染料脫色，導致傳遞給陽極的電子減少，陽極極化明顯.

　　3.3 兩種接種源MFC陽極剛果紅的降解速率和降解產物分析

　　穩定運行階段，MFC-I和MFC-M對剛果紅的脫色率隨時間變化如圖 3所示.在運行周期初的12 h內，MFC-I(16.24 mg · L-1 · h-1)的平均脫色速率比MFC-M(13.50 mg · L-1 · h-1)高20.3%;12 h后脫色速率均明顯降低，MFC-I(4.69 mg · L-1 · h-1)的平均脫色速率比MFC-M(4.10 mg · L-1 · h-1)高14.4%;在48 h內，MFC-I在任一時間點對剛果紅的脫色率均比MFC-M高出4%~20%.這是由于印染廢水污泥在染料的長期馴化下微生物多樣性相對單一，其功能傾向于優先降解染料;結合產電性能比較，可從側面驗證了因剛果紅降解與產電爭奪電子導致的產電性能差異.48 h后，MFC-M和MFC-I對剛果紅的脫色率均達到90%以上，說明在剛果紅的長期馴化后，兩種接種源對反應器的最終脫色率差異不大.

圖 3 穩定運行階段兩種接種源MFC對剛果紅的脫色率-時間曲線

　　兩種接種源MFC陽極的剛果紅脫色產物分析如圖 4和圖 5所示.從色譜峰的出峰時間和峰強度來看，MFC-I和MFC-M中剛果紅脫色產物相同且濃度相當，主要有3種物質：2-氨基-1，4-萘醌(15.394 min)、2，2′-二氨基聯苯(16.345 min)、4，4′-二氨基聯苯(也稱為聯苯胺，17.861 min)，這與孫健等的研究結果一致(Sun et al., 2012).這說明在剛果紅-葡萄糖共基質環境下長期運行，兩種接種源MFC對剛果紅的降解產物和降解效率差異很小.

圖 4 穩定運行階段周期末MFC-I(a)和MFC-M(b)陽極脫色產物氣相色譜圖

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圖 5 穩定運行階段周期末MFC-I和MFC-M陽極脫色產物質譜圖(a.2-氨基-1，4-萘醌，b.2，2′-二氨基聯苯，c.聯苯胺)

　　3.4 生物膜電化學特性

　　CV被廣泛用于研究MFC中細菌與電極表面的電化學交互作用機制(Rabaey et al., 2004;2005;Marsili et al., 2008).為了探究長期運行下，兩種接種源MFC陽極生物膜與電極表面之間的電化學反應特性差異，對穩定運行階段最大輸出電壓時和周期末(電壓低于10 mV，基質幾乎消耗完全)的MFC陽極進行了CV掃描.

　　如圖 6a所示，最大輸出電壓下，MFC-I和MFC-M陽極的CV中均呈現出一對明顯的氧化還原峰，分別為-0.41 V的氧化峰和0.52 V的還原峰(MFC-M)，以及為-0.31 V的氧化峰和0.66 V的還原峰(MFC-I)，但MFC-I氧化還原峰的位置均比MFC-M有些許偏移.這說明二者陽極表面發生氧化還原化學反應的物質不同，可能是兩種接種源生物膜中微生物種群的差異所致(Marsili et al., 2008).同時，由圖 6a可看出，MFC-M的氧化還原峰面積及峰高均明顯大于MFC-I，說明MFC-M生物膜具有更高的電化學活性(Carmona-Martinez et al., 2011).由圖 6b可以看出，與最大電壓下(圖 6a)的CV圖相比，周期末CV圖的氧化還原峰的峰高明顯減小，這是共基質耗盡的結果.此外，氧化還原特征峰發生了不同程度的偏移，參考Rabaey等(2004)的研究，推測是剛果紅脫色產物在陽極表面進一步氧化降解所致.

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圖 6 穩定運行階段最大電壓時(a)和周期末(b)MFC-I和MFC-M陽極的循環伏安曲線

　　CV和GC-MS檢測發現，在MFC-M和MFC-I 周期末CV圖中，電壓約為0.747 V時，均出現了峰電流約為16.3 mA的還原峰，其標準還原電位約為-0.201 V;結合GC-MS分析結果推測該峰為生物膜細菌產生的電子氧化還原介體之一的2-氨基—1，4-萘醌的特征峰(Rau et al., 2002;Fultz et al., 1982).2-氨基—1，4-萘醌的標準氧化還原電位高于細胞脫氫酶NDAH的氧化還原電位值(-0.320 V，Rau et al., 2002)，但低于陽極電勢(約為-0.100 V)和剛果紅標準氧化還原電勢(+0.102 V)，說明2-氨基-1，4-萘醌可作為電子介體協助電子由細胞到陽極和剛果紅分子的傳遞.其次，至今發現的醌類電子介體及其標準氧化還原電位已有2-氨基—3-羧基—1，4-萘醌(-0.071 V)、2-羥基—1，4-萘醌(-0.137 V)、1，2-萘醌(+0.135 V)、1，2-萘醌—4-磺酸(+0.217 V)(Yamazaki et al., 1999;Rau et al., 2002;Fultz et al., 1982;dos Santos et al., 2007)，產物中擁有萘醌結構的2-氨基—1，4-萘醌的標準氧化還原電位約為-0.201 V，與其他醌類電子介體的標準氧化還原電位相近.最后，根據Nortemann等(1994)的研究發現，醌類電子介體是在Pseudomonas sp. BN6降解萘磺酸鹽的過程中由微生物代謝得到的.剛果紅與萘磺酸鹽同樣有醌類基團，且陽極優勢菌種也以Pseudomonas sp.為主(見3.5節).由此推斷，Pseudomonas sp.在代謝剛果紅的過程中，使其斷鍵生成2-氨基—1，4-萘醌，而2-氨基—1，4-萘醌作為電子介體可進一步促進氧化還原反應的進行.

　　采用EIS測定了兩種接種源MFC陽極在最大電壓時的阻抗，其能斯特曲線如圖 7所示，阻抗分析見表 1.圖 7中，曲線高頻部分與X軸的交點對應值為歐姆阻抗Rs，從高頻到低頻得到半圓的擬合直徑為極化阻抗Rct.由表 1可看出，MFC-I和MFC-M陽極的Rs和Rd均較小(約3~5 Ω)，因此，陽極阻抗主要由表征電子傳遞速率的極化阻抗Rct導致.如圖 7和表 1所示，在輸出電壓最大時，MFC-M陽極Rct比MFC-I陽極低38.0%，說明MFC-I的陽極電子供應不足或電子傳遞阻力較大，這與測得的陽極極化曲線一致.因為MFC-I中染料脫色菌較多，加速了剛果紅脫色，消耗了大量來自共基質葡萄糖的電子，致使傳遞給陽極的電子急劇減少.

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圖 7 最大電壓時MFC-I和MFC-M陽極的能斯特曲線(Zre為阻抗Z的實部，Zim為阻抗Z的虛部)

?表1 穩定運行階段最大電壓時MFC-I和MFC-M陽極的內阻分析

?　　3.5 兩種接種源的MFC陽極優勢菌種分析

　　從MFC-M和MFC-I陽極各分離出3株純菌，分別命名為M-P、M-P2、M-B和I-P、I-P2、I-A，繪制系統發育樹如圖 8所示.由圖可知，MFC-M的優勢菌為Pseudomonas sp.(M-P、M-P2)和Bacillus sp.(M-B);MFC-I的優勢菌為Pseudomonas sp.(I-P、I-P2)和Aquamicrobium sp(I-A).其中，I-P和M-P、I-P2和M-P2、I-P和I-P2、M-P和M-P2、I-A和I-P、I-A和M-B、M-B和M-P的同源相似性分別為100%、99%、99%、99%、83%、81%、80%.可見，在一定的環境條件下，接種源微生物多樣性與特征基質決定了MFC陽極優勢菌種.

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圖 8 MFC-I和MFC-M陽極生物膜上優勢菌種的系統發育樹

　　在同步降解剛果紅與產電MFC中的微生物一般可分為兩種：①產電菌，主要負責傳遞電子到電極;②剛果紅降解菌，主要負責降解剛果紅及其脫色產物(Sun et al., 2012).Pseudomonas sp.和Bacillus sp.均為最常見的產電菌屬.其中，Pseudomonas sp.能分泌電子介體(如綠膿菌素)，加速電子由細胞表面到陽極表面的傳遞，并且這類生物型電子介體還可被其他細菌利用，進行種間電子傳遞，增大MFC輸出功率(Rabaey et al., 2004，2005;Logan et al., 2009).而Bacillus sp.在MFC中主要借助溶解性電子介體傳遞電子(Nimje et al., 2009).同時，Pseudomonas sp.和Bacillus sp.也是常見的染料降解菌(Cervantes et al., 2011;Jain et al., 2012).故可以判斷MFC-M在產電和剛果紅降解方面的高效性能歸功于同為產電菌和染料降解菌的優勢菌種Pseudomonas sp.和Bacillus sp..從圖 8中可以看出，在MFC-I中也分離出了與MFC-M中同源性較高的Pseudomonas sp..此外，關于Aquamicrobium sp.雖然在MFC領域中的應用雖然鮮有報道，但已發現其能夠代謝雜環化合物噻吩-2-甲酸叔丁酯(Bambaue et al., 1998)、聯苯和聚氯聯苯(Chang et al., 2013)，因此，極有可能具有降解剛果紅的能力.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。

　　綜上分析可以初步判斷，兩種接種源MFC陽極均存在產電菌和剛果紅降解菌，但由于各優勢菌屬的剛果紅降解與產電途徑和能力的差異，從而導致了二者在同步降解剛果紅與產電過程中功率密度、剛果紅脫色速率和生物膜電化學活性的差異.

　　1)分別以印染廢水污泥和生活污水污泥接種MFC，研究發現，接種源會影響MFC的產電性能.啟動階段，MFC-I的輸出電壓高于MFC-M;但穩定運行階段，二者最大輸出電壓差別不大.穩定運行階段MFC-M最大功率密度比MFC-I高2.11倍，陽極Rct比MFC-I低38.0%，生物膜電化學活性更強.

　　2)接種源同時會影響MFC對剛果紅的脫色性能，但對剛果紅的降解產物沒有影響.MFC-I對剛果紅的脫色速率比MFC-M高14.4%~20.3%，主要降解產物均為2-氨基—1，4-萘醌、2，2′-二氨基聯苯、4，4′-二氨基聯苯.

　　3)接種源還會導致MFC陽極優勢菌種的差異.二者均存在Pseudomonas sp.，但MFC-M陽極還存在優勢菌Bacillus sp.，而MFC-I的陽極還存在優勢菌Aquamicrobium sp.