1 引言

　　酒精是重要的工業原料，已被廣泛應用于生物、化工、食品等各個領域.全球當前又在積極發展燃料酒精，采用燃料酒精代替石油作為車用燃料.然而，酒精生產會伴隨產生大量的高濃度有機廢水，研究發現，每生產1 t酒精，要排放13~16 t廢水，廢水中污染物成分有殘糖、蛋白質、纖維素和鹽分等，具有高化學需氧量(COD)、高生化需氧量(BOD)的特點.厭氧消化是治理酒精生產廢水的主要技術，它既可以高效降解廢水中的有機物，降低廢水的COD和BOD，又可以生產可再生能源-甲烷.此外，該技術還具有占地面積小、運行費用低和污泥產率低等優勢.

　　厭氧消化是利用厭氧微生物在無氧條件下把有機物轉化為甲烷、二氧化碳和少量細胞等，根據運行溫度，可分為高溫厭氧消化((55±2)℃)和中溫厭氧消化((35±2)℃)兩類.厭氧消化的高效、穩定運行依賴于厭氧活性污泥(以下簡稱“污泥”)的微生物菌群，微生物菌群的種類和分布又主要取決于處理廢水的類別和性質.因此，治理不同廢水的污泥微生物菌群研究受到了學者們的關注，尤其是高通量測序技術的應用，它對分析污泥微生物菌群的種類和相對豐度，研究工藝參數對種類和相對豐度的影響，考察污泥中微生物的功能，豐富微生物菌群的基礎理論等方面有著重要意義.高通量測序技術的種類多樣，其中，Illumina MiSeq高通量測序具有操作簡單、準確率高等優點，已成功應用于污泥、食品、土壤、礦山水、海洋水等樣本的微生物菌群分析.

　　我國是酒精生產大國，河南天冠集團是我國酒精定點生產企業，年產酒精98萬t，采用二級厭氧消化技術治理酒精廢水，日產沼氣50萬m3.二級厭氧消化包括高溫厭氧消化((55±2)℃)和中溫厭氧消化((35±2)℃)兩個工序，在高溫厭氧消化工序中，反應器總體積16萬m3，水力停留時間8 d，廢水的COD由(35000±2000)mg·L-1降低至(4000±200)mg·L-1，BOD由(20000±1000)mg·L-1降低至(1400±140)mg·L-1.在中溫厭氧消化工序中，反應器總體積4萬m3，水力停留時間2.5 d，廢水的COD由(3500±200)mg·L-1降低至(2000±150)mg·L-1，BOD由(1200±120)mg·L-1降低至(650±50)mg·L-1.本實驗依托天冠集團的生產規模和技術平臺，首次采用Illumina MiSeq高通量測序研究酒精廢水治理中污泥(高溫厭氧和中溫厭氧)的微生物菌群，在屬(genus)水平分析污泥中細菌和古菌的種類和相對豐度，探討不同菌屬的功能，以期為闡釋厭氧消化技術治理酒精廢水的生物機制及該技術的升級改良提供參考.

　　2 材料與方法

　　2.1 樣品采集

　　厭氧活性污泥取樣于河南天冠集團.在厭氧反應器穩定運行的條件下，高溫厭氧活性污泥分別取樣于16個高溫厭氧反應器后混合，中溫厭氧活性污泥分別取樣于10個中溫厭氧反應器后混合，樣品采集后保存于0 ℃冰盒中并快速移至-80 ℃冰箱中長期保存.

　　2.2 實驗方法

　　2.2.1 DNA提取

　　厭氧活性污泥中微生物的DNA按照OMEGA試劑盒說明書的方法和步驟進行提取.

　　2.2.2 PCR擴增及測序

　　擴增16S rDNA的V3~V4區域，細菌的PCR引物是Miseq測序平臺的通用引物是341F: 5′-CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，805R: 5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACT ACHVGGGTATCTAATCC-3′.古菌的PCR引物是349F: 5′-CCCTACACGACGC TCTTCCGATCTN(barcode)GYGCASCAGKCG MGAA W-3′，806R:5′-GACTGGAGTTCCTTGGCA CCCGAG AATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3′.為了確定測序的樣品來源，PCR引物中標簽序列的插入位置標記為barcode.引物中barcode前面的序列是接頭序列，用于識別測序位置，barcode后面的序列是引物序列.通過兩輪PCR擴增并完成接頭序列的連接，PCR產物在Illumina Miseq高通量測序儀(美國，Illumina公司)上進行測序.第一輪PCR擴增，50 μL反應體系為：10×PCR buffer 5 μL，0.1 mmol·L-1 dNTPs，10 ng DNA，0.5 μmol·L-1 PCR primer F，0.5 μmol·L-1 Primer R，0.05 U Plantium Taq.PCR擴增條件為：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，5個循環;94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環;72 ℃延伸5 min.第一輪PCR產物進行第二輪擴增，擴增反應體系中DNA為20 ng，其他與第一輪擴增一致，PCR擴增條件為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，5個循環;72 ℃延伸5 min.第二輪PCR產物進行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對DNA進行回收.利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，依托生工生物工程(上海)股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序.

　　2.3 數據分析

　　測序獲取原始序列，將雙末端序列融合為一個方向的序列并進行質量控制，步驟如下：(1) 序列融合，采用Flash軟件(版本1.2.3)融合雙末端序列，通過各樣品的barcode使數據回歸樣品，并對各樣品序列做質量控制(QC).(2) QC分為4個步驟：①采用Prinseq(版本V0.20.4)軟件對序列閱讀框的3′端進行質控，截掉Q值低于20的數據，提高后續序列融合比率;②通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列;③采用Prinseq軟件去除各樣品的引物序列、低于200 bp的序列、低復雜度序列和低質量序列;④去除非靶區域序列及嵌合體.首先采用軟件Mothur(版本1.30.1)的Pre.cluster模塊校正測序錯誤，校正過程當中允許的最大錯配為1/150.其次，采用軟件Mothur(版本1.30.1)內的Uchime功能模塊，以Silva數據庫中的序列作為模板，去除嵌合體及非靶區域序列.

　　3 結果與討論

　　測定序列經質量控制后，根據差異水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚類得到操作分類單元(OTU).實驗獲得高溫厭氧活性污泥中細菌和古菌的有效序列數量分別為20523和33190，聚類得到OTU數目分別為1729和122，中溫厭氧活性污泥中細菌和古菌的序列數量分別為11766和13803，聚類得到OTU數目分別為1701和156.在序列聚類分析的基礎上，實驗在屬(genus)水平上對厭氧活性污泥的細菌和古菌進行分類，統計它們的相對豐度.由于污泥中細菌和古菌的種類繁多，根據相對豐度將污泥中細菌分為優勢細菌(相對豐度≥1.0%)和稀有細菌(相對豐度<1.0%)，古菌分為優勢古菌(相對豐度≥1.0%)和稀有古菌(相對豐度<1.0%)，且將稀有細菌和稀有古菌分別歸類于其他.

　　3.1 高溫厭氧活性污泥的優勢細菌

　　高溫厭氧活性污泥的優勢細菌有10個，包括有Coprothermobacter、Longilinea、Thermodesulfovibrio和Levilinea等，它們的相對豐度如圖 1所示.參考已有研究報道分析它們的功能，結果如表 1所示.由表 1可以歸納出高溫厭氧活性污泥中優勢細菌的主要功能包括4個方面，分別是分解蛋白質、代謝多種碳水化合物生成有機酸、乙酸氧化、硫酸鹽還原.此外，在細菌的測序分析中發現了古菌Methanosaeta，它是生態環境中甲烷的主要生產者.細菌和古菌雖然不是同一個域，但它們的16S rDNA基因序列有較高的同源性(劉馳等，2015)，PCR擴增細菌16S rDNA基因的過程中，通用引物可能結合到古菌Methanosaeta的16S rDNA基因并將其擴增.古菌域中只有Methanosaeta出現在細菌的測序分析中，表明高溫厭氧活性污泥中Methanosaeta的相對豐度高，這與下文關于高溫厭氧活性污泥中優勢古菌的分析結果一致.

　　表 1 高溫厭氧活性污泥中優勢細菌的功能

　　圖 1高溫厭氧活性污泥的優勢細菌名稱及相對豐度

　　3.2 中溫厭氧活性污泥的優勢細菌

　　中溫厭氧活性污泥中優勢細菌有21個，包括有Acinetobacter、Succinibibrio、Meniscus和Longilinea等， 它們的相對豐度如圖 2所示.比較圖 1和圖 2可以看出，中溫厭氧活性污泥中優勢細菌的種類多而相對豐度小.中溫厭氧活性污泥中優勢細菌的功能如表 2所示，由表 2可以歸納出它們的主要功能包括3個方面，分別是代謝多種碳水化合物生成有機酸、脂肪酸和有機酸氧化、分解結構頑固化合物，如纖維素、酚類化合物、腐胺等.

　　圖 2中溫厭氧活性污泥的優勢細菌名稱及相對豐度

　　3.3 厭氧活性污泥的優勢古菌

　　高溫厭氧活性污泥和中溫厭氧活性污泥的優勢古菌及其相對豐度如圖 3所示.可以看出，污泥的古菌種類較少，主要是產甲烷古菌，它們是一類能夠以乙酸、H2/CO2、甲基化合物等為原料生成甲烷的原核微生物.高溫厭氧活性污泥中主要產甲烷古菌是Methanosaeta、Methanobacterium和Methanothermbacter，它們的相對豐度分別為57.72%、28.35%和9.90%.中溫厭氧活性污泥中主要產甲烷古菌是Methanobacterium、Methanosarcina、Methanosaeta和Methanosphaera，它們的相對豐度分別為33.21%、23.70%、16.63%和11.77%.實驗進一步歸納比較厭氧活性污泥中優勢古菌的分布、分類單元(目)和主要代謝底物，結果如表 3所示.可以看出，中溫厭氧活性污泥的優勢古菌種類多于高溫厭氧活性污泥的優勢古菌種類，且高溫厭氧活性污泥和中溫厭氧活性污泥有相同的產甲烷古菌，它們分別是Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanosphaera.產甲烷古菌可分為5個目，分別為甲烷桿菌目、甲烷球菌目、甲烷八疊球菌目、甲烷火菌目和甲烷微菌目，而污泥中產甲烷古菌主要分布于2個目，分別是甲烷八疊球菌目和甲烷桿菌目.

　　圖 3高溫(a)和中溫(b)厭氧活性污泥的優勢古菌名稱及相對豐度

　　3.4 厭氧消化技術治理酒精生產廢水

　　酒精生產廢水的污染物成分有殘糖、蛋白質、纖維素和鹽分等，厭氧消化技術可以高效降解廢水中的有機物，降低廢水的COD和BOD，還可以生產甲烷，具有環境效益和經濟效益.厭氧消化涉及到眾多微生物，各微生物通過直接或間接的營養關系，組成了復雜的互營共生的微生物菌群，消化過程通常分為4個階段：①水解階段，細菌將復雜的有機物分解為簡單的可溶性物質，如蛋白質被分解為短肽、氨基酸等;②產酸發酵階段，細菌將可溶性物質等轉化為有機酸、脂肪酸和醇類等，產物主要有甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、H2和CO2等;③產乙酸階段，是指將產酸發酵階段中二碳以上機酸、脂肪酸和醇類轉化為乙酸、H2和CO2的過程;④產甲烷階段，產甲烷菌以乙酸、H2和CO2為底物生產甲烷，其它甲基化合物如甲酸、甲醇等也可以被轉化為甲烷.

　　根據研究結果(表 1~3)，Illumina MiSeq高通量測序分析得到厭氧活性污泥中細菌的主要功能是分解蛋白質，代謝碳水化合物生成有機酸，降解結構頑固化合物，氧化有機酸和脂肪酸生成H2和CO2等.厭氧活性污泥中古菌主要是產甲烷古菌，它們能夠利用乙酸、H2和CO2等底物生成甲烷.污泥中細菌和古菌的代謝功能與酒精生產廢水的污染物成分有良好的對應關系，表明Illumina MiSeq高通量測序有效，充分地展示了酒精廢水治理中厭氧活性污泥的微生物菌群.此外，在厭氧活性污泥的菌群分析中，發現了硫酸鹽還原菌Thermogymnomonas(相對豐度5.67%)、Thermodesulfovibrio(相對豐度4.87%)和Thermodesulfobium(相對豐度1.17%).這是由于酒精生產的淀粉質原料(木薯、玉米等)經過蒸煮糖化得到糖化醪，醪液需利用濃硫酸調節至pH 4.0~5.0范圍后用于發酵生產酒精，導致酒精生產廢水含有一定量的硫酸鹽.厭氧活性污泥在治理酒精廢水過程中長期馴化，使得硫酸鹽還原菌成為優勢菌.酒精企業多采用二級厭氧消化技術治理生產廢水，有高溫厭氧消化和中溫厭氧消化兩個工序.兩個工序的作用都是降解有機物生產甲烷，但特點不同.高溫厭氧消化的有機負荷高，微生物代謝速率快，但一些結構頑固的化合物未被有效降解，高溫厭氧消化的出水COD較高.在高溫厭氧消化后繼續進行中溫厭氧消化，進一步轉化分解有機物，降低出水COD.實驗分析發現，高溫厭氧活性污泥和中溫厭氧活性污泥中多種優勢細菌(Longilinea、Bellilinea和Levilinea)和優勢古菌(Methanosaeta、Methanosarcina、Methanobacterium和Methanosphaera)是相同的，但污泥的細菌差異程度高于古菌差異程度，中溫厭氧活性污泥中優勢細菌的種類多，相對豐度小，且有多種能夠代謝結構頑固化合物(Clostridium III、Serratia和Anaerovorax)的細菌.可以看出，在厭氧消化技術治理酒精廢水的過程中，高溫厭氧消化和中溫厭氧消化的相同作用使得污泥中有部分相同的細菌和古菌，它們的不同特點主要取決于污泥中細菌的種類和相對豐度.

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　　表 3 厭氧活性污泥中優勢古菌的分布、分類單位和主要代謝底物

　　4 結論

　　實驗基于Illumina MiSeq高通量測序研究酒精廢水治理中厭氧活性污泥的微生物菌群.結果發現，高溫厭氧活性污泥(TAS)中優勢細菌有Coprothermobacter、Longilinea、Levilinea等，它們的主要功能是分解蛋白質、代謝碳水化合物生成有機酸、乙酸氧化、硫酸鹽還原.中溫厭氧活性污泥(MAS)中優勢細菌有Acinetobacter、Succinibibrio、Meniscus等，它們的主要功能是代謝碳水化合物生成有機酸、脂肪酸和有機酸氧化、代謝結構頑固化合物.TAS和MAS的古菌主要是產甲烷古菌，分布于甲烷八疊球菌目和甲烷桿菌目.TAS中產甲烷古菌主要有Methanosaeta(相對豐度57.72%)、Methanobacterium(相對豐度28.35%)和Methanothermbacter(相對豐度9.90%).MAS中產甲烷古菌主要有Methanobacterium(相對豐度33.21%)、Methanosarcina(相對豐度23.70%)、Methanosaeta(豐度16.63%)和Methanosphaera(相對豐度11.77%).高通量測序充分展示了酒精廢水治理中厭氧活性污泥的微生物菌群，可為闡釋厭氧消化技術的生物機制和升級改良該技術提供參考.