1 引言

　　生物柴油，即脂肪酸甲酯具備可再生性、環(huán)境友好性(比化石燃料更清潔)及可用于柴油發(fā)動(dòng)機(jī)的兼容性等特點(diǎn)，因而極具應(yīng)用前景.但目前用于生物柴油生產(chǎn)的油脂原料成本較高，一般可占到成本的70%~85%(Haas et al., 2005)，因此，開(kāi)發(fā)并利用成本低廉且易于大規(guī)模獲得的油脂原料就顯得尤為重要.目前，相關(guān)研究中提到的替代油料主要包括：非食用作物、動(dòng)物脂肪、地溝油、微生物油脂和活性污泥.研究表明，污水處理廠廢水處理過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的剩余污泥，這些污泥的處理處置成本占到廢水處理成本的50%~60%.且當(dāng)前的剩余污泥處理處置方式主要是焚燒和填埋，這會(huì)造成環(huán)境污染和土地資源浪費(fèi)等問(wèn)題.利用活性污泥作為油料生產(chǎn)制備生物柴油，具有環(huán)境友好、成本低廉和原料豐富易得等特點(diǎn)，有著不可忽視的巨大應(yīng)用潛力.

　　然而，當(dāng)前利用活性污泥生產(chǎn)制備生物柴油尚處于研究階段.利用活性污泥制備生物柴油的方案主要有兩種：①直接甲酯化(一步法);②先將活性污泥預(yù)處理，提取得到油脂后再進(jìn)行甲酯化(兩步法).Mondala等(2009)的研究表明，在75 ℃使用體積分?jǐn)?shù)5%的硫酸甲醇溶液與干污泥在質(zhì)量比為12 ∶ 1的條件下，利用一步法可得到最高的生物柴油產(chǎn)量;而Pastore等(2013)則指出，利用兩步法制備生物柴油，其產(chǎn)量高于一步法.此外，不同研究在提取油脂過(guò)程中采用的細(xì)胞破壁方法、油脂萃取溶劑也不盡相同.目前采用的破壁方法主要有菌株自溶法、超聲破碎法、高壓均漿破碎法、化學(xué)破碎法、微波破碎法、凍融法等.而提取溶劑則決定了提取過(guò)程的時(shí)間、提取物量的大小和種類(lèi).Bligh等(1959)提出利用體積比為2 ∶ 1的氯仿-甲醇提取動(dòng)物組織中的油脂，發(fā)現(xiàn)提　　取效果極佳，因此，至今仍被用于活性污泥油脂提取則利用體積比為3 ∶ 1 ∶ 1的正己烷-甲醇-丙酮提取活性污泥中的油脂，也取得了較好的效果.活性污泥是由細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物等組成的混合菌群，針對(duì)混合菌群采用哪種破壁方法及油脂萃取溶劑最有效還有待研究.

　　因此，本研究采用4種破壁方法、兩種油脂萃取溶劑組合及兩種甲酯化方案，分別對(duì)活性污泥進(jìn)行生物柴油制備，考察其對(duì)活性污泥制備生物柴油產(chǎn)量及脂肪酸甲酯組分的影響，最終提出適合用于活性污泥制備生物柴油的方法.

　　2 材料與方法

　　2.1 實(shí)驗(yàn)裝置和SBR運(yùn)行

　　實(shí)驗(yàn)裝置采用SBR運(yùn)行模式的有機(jī)玻璃柱(直徑6 cm，高100 cm)，有效工作體積為2.4 L.接種污泥取自北京肖家河污水處理廠，反應(yīng)器初始污泥濃度(MLSS)為3000 mg · L-1.反應(yīng)器運(yùn)行周期為72 h，每個(gè)周期包含40 min污泥沉降、10 min上清液排出和10 min進(jìn)水過(guò)程，曝氣時(shí)間為71 h，曝氣方式采用鼓風(fēng)曝氣，供氣流量為2.0 L · min-1.人工配制含糖廢水培養(yǎng)活性污泥，含糖廢水中以葡萄糖和氯化銨分別作為碳源和氮源，COD值為3000 mg · L-1，碳氮比為100 ∶ 5，其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)包括：KH2PO4 6.6 mg · L-1，Na2HPO4 20.1 mg · L-1，以及少量微量元素.運(yùn)行期間加入適量NaHCO3溶液作為緩沖液，保持反應(yīng)器pH在7.0~8.0，反應(yīng)器在室溫下運(yùn)行，水溫保持在20~22 ℃，污泥主要相關(guān)參數(shù)詳見(jiàn)表 1.實(shí)驗(yàn)活性污泥樣品全部取于反應(yīng)器運(yùn)行約60 h時(shí).

　　2.2 活性污泥破壁方法

　　為避免常規(guī)預(yù)處理步驟中污泥干燥的成本和時(shí)間，將活性污泥在5000 r · min-1條件下離心5 min，得到脫水的活性污泥(TSS約為12%)，作為生物柴油生產(chǎn)原材料.稱(chēng)取一定量脫水污泥于105 ℃ 烘干，換算成干重.污泥樣品使用不同的方法進(jìn)行細(xì)胞破碎，包括鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法、超聲法和液氮法(表 2).其中，鹽酸加熱法和鹽酸加熱超聲法參考王敏(2009)對(duì)粘紅酵母油脂研究中的酸熱法和酸熱耦合超聲法，并對(duì)水浴及超聲時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化.對(duì)活性污泥進(jìn)行超聲會(huì)產(chǎn)生一定熱量，使得溫度提高.有研究表明，在不控溫的情況下細(xì)胞破碎效果更好(Sheng et al., 2012)，因此，本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有進(jìn)行溫度控制.所有實(shí)驗(yàn)保證3個(gè)平行樣品.

　　將1 g經(jīng)破壁處理的脫水污泥，與22.5 mL體積比為2 ∶ 1的二氯甲烷-甲醇溶液或25 mL體積比為3 ∶ 1 ∶ 1的正己烷-甲醇-丙酮溶液混合，混合液于室溫下150 r · min-1振搖30 min，然后5000 r · min-1離心15 min.取二氯甲烷層或正己烷層置于50 ℃的水浴鍋加熱至恒重，采用重量法測(cè)定脂類(lèi)提取物總量.然后向提取物中加入5 mL甲醇和0.25 mL濃硫酸，75 ℃恒溫水浴1.5 h.加入5 mL飽和的NaCl溶液，并用15 mL正己烷萃取3次，加入5 mL質(zhì)量體積比為20 g · L-1的碳酸氫鈉中和酸性及適量無(wú)水硫酸鈉脫水，取正己烷層在80 ℃條件下蒸干，得到黃色透明粘稠液體，即為FAMEs，采用重量法進(jìn)行總量測(cè)定，然后對(duì)其進(jìn)行GC-MS組分分析.

　　2.4 制備生物柴油一步法

　　向經(jīng)破壁處理的4 g脫水污泥中加入30 mL甲醇和1.5 mL濃硫酸，75 ℃恒溫水浴7 h使反應(yīng)完全.加入5 mL飽和NaCl溶液，用30 mL正己烷萃取3次，加入10 mL 20 g · L-1的碳酸氫鈉中和酸性及適量無(wú)水硫酸鈉脫水，取正己烷層在80 ℃條件下蒸干，采用重量法進(jìn)行FAMEs總量測(cè)定，然后對(duì)其進(jìn)行GC-MS組分分析.一步法中的普通法，即不采取任何破壁手段，直接進(jìn)行甲酯化處理.

　　2.5 FAMEs組分分析

　　所有FAMEs樣品于-20 ℃冷凍保存.將樣品用適量正己烷溶解，0.45 μm PTFE膜過(guò)濾，利用配有質(zhì)譜儀的Varian 4000氣相色譜儀進(jìn)行分析.色譜條件：色譜柱為30 m×0.250 mm×0.25 μm Agilent J&W DB-5MS UI毛細(xì)管柱，升溫程序設(shè)定為以10 ℃ · min-1從70 ℃提高到130 ℃，以4 ℃ · min-1從130 ℃提高到200 ℃，以3 ℃ · min-1從200 ℃升至220 ℃，最后以5 ℃ · min-1從220 ℃升至270 ℃，并保持2 min，進(jìn)樣口溫度設(shè)定為270 ℃，載氣為高純氮?dú)猓髁繛? mL · min-1，分流比為20 ∶ 1.質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊，電子能量為70 eV，離子源溫度200 ℃，倍增器電壓2000 V，掃描范圍50~400 amu.利用14種C8~C24的FAME混標(biāo)(18918-1AMP，Sigma-Aldrich，美國(guó))對(duì)具體組分進(jìn)行定性分析.

　　3 結(jié)果與討論

　　3.1 破壁方法對(duì)兩步法制備生物柴油的影響

　　由于細(xì)菌積累的油脂主要集中于胞內(nèi)，因此，破壞細(xì)胞壁是一個(gè)關(guān)鍵的步驟.本實(shí)驗(yàn)分別采用鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法、超聲法和液氮法對(duì)活性污泥進(jìn)行破壁處理，然后進(jìn)行油脂提取和甲酯化反應(yīng).兩步法脂類(lèi)提取物產(chǎn)量如圖 1 a所示，以二氯甲烷-甲醇為油脂提取溶劑時(shí)，4種破壁方法中，鹽酸加熱法和鹽酸加熱超聲法每克干泥所得脂類(lèi)提取物質(zhì)量最多，產(chǎn)量分別為(117.3±1.8)、(107.2±1.1)mg · g-1，效果最佳.超聲法效果較差，脂類(lèi)提取物產(chǎn)量為(57.6±3.7)mg · g-1，約為上述兩種方法所得量的50%.液氮法效果最差，脂類(lèi)提取物產(chǎn)量為(29.4±3.2)mg · g-1，與其他方法差距明顯.以正己烷-甲醇-丙酮為油脂提取溶劑時(shí)，鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法和超聲法的效果差別不大，脂類(lèi)提取物產(chǎn)量分別為(53.2±2.0)、(48.5±3.1)、(47.1±4.0)mg · g-1.液氮法的效果依然最差，脂類(lèi)提取物產(chǎn)量?jī)H為(23.3±1.8)mg · g-1.結(jié)果表明，鹽酸加熱超聲法中超聲的效果并不明顯，此方法中超聲功率為200 W，主要用來(lái)促進(jìn)鹽酸破壁和油脂溶解，與超聲法1000 W的目的不同.鹽酸加熱法主要利用鹽酸對(duì)細(xì)胞壁中糖及蛋白質(zhì)等成分的作用，使原來(lái)結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得松散，再經(jīng)沸水浴及速冷處理，使細(xì)胞壁進(jìn)一步被破壞，破碎效果好.超聲法主要利用其對(duì)媒介產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)作用和空化作用達(dá)到細(xì)胞破碎的目的，但可能由于能量分布不均，功率不足等原因，破壁效果不如預(yù)期.液氮法對(duì)粘紅酵母的破壁效果較好，但可能由于活性污泥具有菌膠團(tuán)結(jié)構(gòu)，冷凍破壁效果不明顯.綜上，在兩步法的破壁階段，鹽酸加熱法破壁效果最好，超聲法其次，液氮法最差.

　　圖 1 兩步法不同破壁方法每克干泥對(duì)應(yīng)脂類(lèi)提取物質(zhì)量(a)及FAMEs質(zhì)量(b)

　　甲酯化后所得FAMEs產(chǎn)量如圖 1 b所示，可以看出，只有一部分脂類(lèi)提取物被甲酯化，與其他文獻(xiàn)(Dufreche et al.， 2007; Mondala et al.， 2009)結(jié)果類(lèi)似，原因可能是提取物中含有其他不參與甲酯化的脂類(lèi)物質(zhì).所得FAMEs產(chǎn)量基本與脂類(lèi)提取物產(chǎn)量成正比，其中，鹽酸加熱法(二氯甲烷提取：(60.4±3.5)mg · g-1，正己烷提取：(45.5±3.2)mg · g-1)與鹽酸加熱超聲法(二氯甲烷提取：(53.2±0.3)mg · g-1，正己烷提取：(43.3±4.1)mg · g-1)有較明顯的優(yōu)勢(shì)，超聲法其次(二氯甲烷提取：(42.7±2.5)mg · g-1，正己烷提取：(38.2±3.9)mg · g-1)，液氮法甲酯化后產(chǎn)量依然很低(二氯甲烷提取：(22.4±4.4)mg · g-1，正己烷提取：(27.3±2.2)mg · g-1).

　　通過(guò)GC-MS分析，兩步法所得FAMEs產(chǎn)物組成成分如表 3所示.鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法和超聲法所得成分基本相同，共13種，其中，含量較高的包括12-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、棕櫚油酸甲酯(C16 ∶ 1)、棕櫚酸甲酯(C16 ∶ 0)和油酸甲酯(C18 ∶ 1).超聲法所得C18 ∶ 0和C16 ∶ 0兩種脂肪酸甲酯含量較其他方法偏高，原因可能是高能量的超聲波對(duì)油脂有一定的破壞作用，促進(jìn)細(xì)菌 細(xì)胞偏外側(cè)的油脂生成游離脂肪酸從而提高了FAMEs的轉(zhuǎn)化率.液氮法所得FAMEs含量和種類(lèi)都很少，表明該方法并不適用于活性污泥細(xì)胞壁破碎.在同類(lèi)研究中所得生物柴油成分多集中于C16~C18，沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)帶支鏈的FAMEs(Dufreche et al., 2007; Mondala et al., 2009; Revellame et al., 2012)，而細(xì)菌脂肪酸(尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌)的特點(diǎn)就是很少有雙鍵但常被羥化或者含有支鏈(Sasser，1990)，當(dāng)細(xì)菌處于低溫環(huán)境時(shí)，細(xì)胞膜上的脂肪酸不飽和度會(huì)增加，從而增加其低溫流動(dòng)性.

　　3.2 油脂提取溶劑對(duì)兩步法制備生物柴油的影響

　　如圖 1a所示，相比于正己烷-甲醇-丙酮，甲醇-二氯甲烷能夠得到更多的脂類(lèi)提取物，且甲酯化反應(yīng)后可得到更多生物柴油.采用甲醇-二氯甲烷提取油脂，最高可獲得(60.4±3.5)mg · g-1 的FAMEs，而采用正己烷-甲醇-丙酮溶劑，F(xiàn)AMEs的最高產(chǎn)量為(45.5±3.2)mg · g-1.FAMEs產(chǎn)量與總脂類(lèi)提取物的比值如圖 2所示，采用二氯甲烷提取，破壁方法為鹽酸加熱法和鹽酸加熱超聲法的比值在0.5左右，超聲法和液氮法的比值在0.75左右，而正己烷提取的方法比值均在0.8以上.結(jié)果表明，二氯甲烷提取到了更多無(wú)法被甲酯化的物質(zhì).有研究表明(Revellame et al., 2012)，采用甲醇-二氯甲烷溶劑不僅從活性污泥中提取到用于生產(chǎn)FAMEs的脂類(lèi)物質(zhì)，還能提取出其他高附加值產(chǎn)物，如聚羥基脂肪酸酯(PHAs).該物質(zhì)是一種天然的高分子生物材料，具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的熱加工性能，可作為生物醫(yī)用材料和生物可降解包裝材料，但目前其相對(duì)于傳統(tǒng)塑料的高價(jià)格束縛了它的應(yīng)用領(lǐng)域.在實(shí)際應(yīng)用中，如果只是單純制備FAMEs，可以考慮采用正己烷-甲醇-丙酮油脂提取溶劑;如果采用甲醇-二氯甲烷油脂提取溶劑，不僅能保證FAMEs的制備，還可能提取制備出多種高附加值產(chǎn)物.

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　　圖 2 FAMEs產(chǎn)量與脂類(lèi)提取物產(chǎn)量比值

　　在FAMEs成分上，兩種溶劑組合沒(méi)有明顯差異(表 3).組分中都包括以下帶甲基支鏈的脂肪酸甲酯：9-甲基十四烷酸甲酯、12-甲基十三烷酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯;不飽和脂肪酸甲酯：棕櫚油酸甲酯(C16 ∶ 1)和油酸甲酯(C18 ∶ 1).只是在采用液氮冷凍破壁的情況下，相對(duì)于甲醇-二氯甲烷，正己烷-甲醇-丙酮提取油脂使其甲酯化后，無(wú)法檢測(cè)到9-甲基十四烷酸甲酯、油酸甲酯(C18 ∶ 1)及硬脂酸甲酯(C18 ∶ 0).Knothe(2005)對(duì)生物柴油的研究中指出，生物柴油一般低溫流動(dòng)性差，低溫容易結(jié)晶，堵塞過(guò)濾器，導(dǎo)致不能從油箱泵送到發(fā)動(dòng)機(jī)，造成無(wú)法啟動(dòng)，嚴(yán)重制約了生物柴油的使用，而脂肪酸甲酯中雙鍵和支鏈數(shù)目的增加，能夠增大分子間距，在一定程度上增加其低溫流動(dòng)性，但不飽和鍵過(guò)多會(huì)導(dǎo)致生物柴油的抗氧化能力變?nèi)?

　　3.3 破壁方法對(duì)一步法制備生物柴油的影響

　　一步法每克干泥所得FAMEs質(zhì)量如圖 3所示，一步法中超聲法產(chǎn)量最高，F(xiàn)AMEs產(chǎn)量為(45.5±3.2)mg · g-1，普通法其次，F(xiàn)AMEs產(chǎn)量為(40.7±0.7)mg · g-1，鹽酸法和鹽酸超聲法產(chǎn)量較低，分別為(29.8±4.3)mg · g-1和(33.4±2.6)mg · g-1，液氮法最低，產(chǎn)量為(27.2±4.2)mg · g-1.在一步法中，硫酸是關(guān)鍵的因素，它不但是酯化反應(yīng)的催化劑，而且可以將一些脂肪酸鹽轉(zhuǎn)化為脂肪酸參與酯化反應(yīng)，同時(shí)硫酸有很好的破壞細(xì)胞壁效果，本實(shí)驗(yàn)中用到的體積比為5%的硫酸-甲醇在同類(lèi)實(shí)驗(yàn)中屬于較高的濃度，可兼顧破壁和甲酯化反應(yīng)，因此，普通法也可以得到比較高的脂肪酸甲酯產(chǎn)量.Pastore等(2013)的研究表明，在甲酯化反應(yīng)中，在一定范圍內(nèi)硫酸的濃度越高，得到的脂肪酸甲酯的量也就越大.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲法有助于提高產(chǎn)量，而鹽酸法和鹽酸超聲法反而降低了脂肪酸甲酯的產(chǎn)量.這很可能是因?yàn)轷セ磻?yīng)為可逆反應(yīng)，鹽酸含有較多的水，促使甲酯化反應(yīng)向相反方向移動(dòng)，即水會(huì)和甘油酯或脂肪酸甲酯反應(yīng)生成游離脂肪酸，降低脂肪酸甲酯產(chǎn)率.因此，盡管鹽酸法和鹽酸超聲法有比較強(qiáng)的破壁效果，但并不適用于一步法.

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　　圖 3 一步法不同破壁方法每克干泥對(duì)應(yīng)的FAMEs質(zhì)量

　　一步法脂肪酸甲酯產(chǎn)物組成如表 4所示，幾種破壁方法的甲酯化產(chǎn)物組成基本一致，同樣出現(xiàn)了上述5種含有甲基支鏈的脂肪酸甲酯及2種單不飽和脂肪酸甲酯.但在沒(méi)有破壁處理的酯化反應(yīng)后，沒(méi)有檢測(cè)到12-甲基十三烷酸甲酯，而采用鹽酸加熱超聲法和液氮法破壁后，則無(wú)法檢測(cè)到硬脂酸甲酯(C18 ∶ 0).總體而言，在成分上與采用鹽酸加熱或鹽酸加熱超聲破壁的兩步法基本一致.

　　3.4 甲酯化方案對(duì)生物柴油制備的影響

　　對(duì)一步法和兩步法中脂肪酸甲酯產(chǎn)量最高的兩種制備方法(即超聲一步法和鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取兩步法)進(jìn)行比較，鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取兩步法可以得(60.4±3.5)mg · g-1生物柴油，超聲一步法可以得到(45.5±3.2)mg · g-1生物柴油，兩步法產(chǎn)量明顯高于一步法，在脂肪酸甲酯組成上兩種方法沒(méi)有明顯差別.鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取這種方法在制備生物柴油量上有明顯優(yōu)勢(shì)，而超聲一步法雖然產(chǎn)量稍低，但制備步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，所用化學(xué)試劑較少，也不失為一種實(shí)用且相對(duì)環(huán)境友好的生物柴油制備方法.在實(shí)際工程應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體情況，綜合考慮各種因素，選取最適合的剩余污泥制備生物柴油方法.具體參見(jiàn) 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結(jié)論

　　1)制備生物柴油兩步法中采用鹽酸加熱破壁的效果最好，而制備生物柴油一步法則是采用超聲破壁的產(chǎn)量最高.

　　2)采用甲醇-二氯甲烷溶劑提取油脂，相比正己烷-甲醇-丙酮溶劑能夠得到更多脂類(lèi)物質(zhì)及較高的生物柴油產(chǎn)量.

　　3)鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取的兩步法在制備生物柴油產(chǎn)量上有明顯優(yōu)勢(shì)，超聲破壁一步法雖產(chǎn)量偏低，但因其步驟簡(jiǎn)單，化學(xué)試劑用量少，在大規(guī)模生產(chǎn)中也有很好的應(yīng)用價(jià)值.

　　4)不同的甲酯化方案對(duì)脂肪酸甲酯成分的影響不大，出現(xiàn)的帶支鏈的細(xì)菌脂肪酸甲酯和不飽和脂肪酸甲酯很可能對(duì)改善生物柴油的低溫流動(dòng)性有一定的意義.