1 引言
生物柴油，即脂肪酸甲酯具備可再生性、環境友好性(比化石燃料更清潔)及可用于柴油發動機的兼容性等特點，因而極具應用前景.但目前用于生物柴油生產的油脂原料成本較高，一般可占到成本的70%~85%(Haas et al., 2005)，因此，開發并利用成本低廉且易于大規模獲得的油脂原料就顯得尤為重要.目前，相關研究中提到的替代油料主要包括：非食用作物、動物脂肪、地溝油、微生物油脂和活性污泥.研究表明，污水處理廠廢水處理過程中會產生大量的剩余污泥，這些污泥的處理處置成本占到廢水處理成本的50%~60%.且當前的剩余污泥處理處置方式主要是焚燒和填埋，這會造成環境污染和土地資源浪費等問題.利用活性污泥作為油料生產制備生物柴油，具有環境友好、成本低廉和原料豐富易得等特點，有著不可忽視的巨大應用潛力.
然而，當前利用活性污泥生產制備生物柴油尚處于研究階段.利用活性污泥制備生物柴油的方案主要有兩種：①直接甲酯化(一步法);②先將活性污泥預處理，提取得到油脂后再進行甲酯化(兩步法).Mondala等(2009)的研究表明，在75 ℃使用體積分數5%的硫酸甲醇溶液與干污泥在質量比為12 ∶ 1的條件下，利用一步法可得到最高的生物柴油產量;而Pastore等(2013)則指出，利用兩步法制備生物柴油，其產量高于一步法.此外，不同研究在提取油脂過程中采用的細胞破壁方法、油脂萃取溶劑也不盡相同.目前采用的破壁方法主要有菌株自溶法、超聲破碎法、高壓均漿破碎法、化學破碎法、微波破碎法、凍融法等.而提取溶劑則決定了提取過程的時間、提取物量的大小和種類.Bligh等(1959)提出利用體積比為2 ∶ 1的氯仿-甲醇提取動物組織中的油脂，發現提 取效果極佳，因此，至今仍被用于活性污泥油脂提取則利用體積比為3 ∶ 1 ∶ 1的正己烷-甲醇-丙酮提取活性污泥中的油脂，也取得了較好的效果.活性污泥是由細菌、真菌、原生動物等組成的混合菌群，針對混合菌群采用哪種破壁方法及油脂萃取溶劑最有效還有待研究.
因此，本研究采用4種破壁方法、兩種油脂萃取溶劑組合及兩種甲酯化方案，分別對活性污泥進行生物柴油制備，考察其對活性污泥制備生物柴油產量及脂肪酸甲酯組分的影響，最終提出適合用于活性污泥制備生物柴油的方法.
2 材料與方法
2.1 實驗裝置和SBR運行
實驗裝置采用SBR運行模式的有機玻璃柱(直徑6 cm，高100 cm)，有效工作體積為2.4 L.接種污泥取自北京肖家河污水處理廠，反應器初始污泥濃度(MLSS)為3000 mg · L-1.反應器運行周期為72 h，每個周期包含40 min污泥沉降、10 min上清液排出和10 min進水過程，曝氣時間為71 h，曝氣方式采用鼓風曝氣，供氣流量為2.0 L · min-1.人工配制含糖廢水培養活性污泥，含糖廢水中以葡萄糖和氯化銨分別作為碳源和氮源，COD值為3000 mg · L-1，碳氮比為100 ∶ 5，其他營養物質包括：KH2PO4 6.6 mg · L-1，Na2HPO4 20.1 mg · L-1，以及少量微量元素.運行期間加入適量NaHCO3溶液作為緩沖液，保持反應器pH在7.0~8.0，反應器在室溫下運行，水溫保持在20~22 ℃，污泥主要相關參數詳見表 1.實驗活性污泥樣品全部取于反應器運行約60 h時.
2.2 活性污泥破壁方法
為避免常規預處理步驟中污泥干燥的成本和時間，將活性污泥在5000 r · min-1條件下離心5 min，得到脫水的活性污泥(TSS約為12%)，作為生物柴油生產原材料.稱取一定量脫水污泥于105 ℃ 烘干，換算成干重.污泥樣品使用不同的方法進行細胞破碎，包括鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法、超聲法和液氮法(表 2).其中，鹽酸加熱法和鹽酸加熱超聲法參考王敏(2009)對粘紅酵母油脂研究中的酸熱法和酸熱耦合超聲法，并對水浴及超聲時間進行了優化.對活性污泥進行超聲會產生一定熱量，使得溫度提高.有研究表明，在不控溫的情況下細胞破碎效果更好(Sheng et al., 2012)，因此，本實驗沒有進行溫度控制.所有實驗保證3個平行樣品.
將1 g經破壁處理的脫水污泥，與22.5 mL體積比為2 ∶ 1的二氯甲烷-甲醇溶液或25 mL體積比為3 ∶ 1 ∶ 1的正己烷-甲醇-丙酮溶液混合，混合液于室溫下150 r · min-1振搖30 min，然后5000 r · min-1離心15 min.取二氯甲烷層或正己烷層置于50 ℃的水浴鍋加熱至恒重，采用重量法測定脂類提取物總量.然后向提取物中加入5 mL甲醇和0.25 mL濃硫酸，75 ℃恒溫水浴1.5 h.加入5 mL飽和的NaCl溶液，并用15 mL正己烷萃取3次，加入5 mL質量體積比為20 g · L-1的碳酸氫鈉中和酸性及適量無水硫酸鈉脫水，取正己烷層在80 ℃條件下蒸干，得到黃色透明粘稠液體，即為FAMEs，采用重量法進行總量測定，然后對其進行GC-MS組分分析.
2.4 制備生物柴油一步法
向經破壁處理的4 g脫水污泥中加入30 mL甲醇和1.5 mL濃硫酸，75 ℃恒溫水浴7 h使反應完全.加入5 mL飽和NaCl溶液，用30 mL正己烷萃取3次，加入10 mL 20 g · L-1的碳酸氫鈉中和酸性及適量無水硫酸鈉脫水，取正己烷層在80 ℃條件下蒸干，采用重量法進行FAMEs總量測定，然后對其進行GC-MS組分分析.一步法中的普通法，即不采取任何破壁手段，直接進行甲酯化處理.
2.5 FAMEs組分分析
所有FAMEs樣品于-20 ℃冷凍保存.將樣品用適量正己烷溶解，0.45 μm PTFE膜過濾，利用配有質譜儀的Varian 4000氣相色譜儀進行分析.色譜條件：色譜柱為30 m×0.250 mm×0.25 μm Agilent J&W DB-5MS UI毛細管柱，升溫程序設定為以10 ℃ · min-1從70 ℃提高到130 ℃，以4 ℃ · min-1從130 ℃提高到200 ℃，以3 ℃ · min-1從200 ℃升至220 ℃，最后以5 ℃ · min-1從220 ℃升至270 ℃，并保持2 min，進樣口溫度設定為270 ℃，載氣為高純氮氣，柱流量為1 mL · min-1，分流比為20 ∶ 1.質譜條件：電離方式為電子轟擊，電子能量為70 eV，離子源溫度200 ℃，倍增器電壓2000 V，掃描范圍50~400 amu.利用14種C8~C24的FAME混標(18918-1AMP，Sigma-Aldrich，美國)對具體組分進行定性分析.
3 結果與討論
3.1 破壁方法對兩步法制備生物柴油的影響
由于細菌積累的油脂主要集中于胞內，因此，破壞細胞壁是一個關鍵的步驟.本實驗分別采用鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法、超聲法和液氮法對活性污泥進行破壁處理，然后進行油脂提取和甲酯化反應.兩步法脂類提取物產量如圖 1 a所示，以二氯甲烷-甲醇為油脂提取溶劑時，4種破壁方法中，鹽酸加熱法和鹽酸加熱超聲法每克干泥所得脂類提取物質量最多，產量分別為(117.3±1.8)、(107.2±1.1)mg · g-1，效果最佳.超聲法效果較差，脂類提取物產量為(57.6±3.7)mg · g-1，約為上述兩種方法所得量的50%.液氮法效果最差，脂類提取物產量為(29.4±3.2)mg · g-1，與其他方法差距明顯.以正己烷-甲醇-丙酮為油脂提取溶劑時，鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法和超聲法的效果差別不大，脂類提取物產量分別為(53.2±2.0)、(48.5±3.1)、(47.1±4.0)mg · g-1.液氮法的效果依然最差，脂類提取物產量僅為(23.3±1.8)mg · g-1.結果表明，鹽酸加熱超聲法中超聲的效果并不明顯，此方法中超聲功率為200 W，主要用來促進鹽酸破壁和油脂溶解，與超聲法1000 W的目的不同.鹽酸加熱法主要利用鹽酸對細胞壁中糖及蛋白質等成分的作用，使原來結構緊密的細胞壁變得松散，再經沸水浴及速冷處理，使細胞壁進一步被破壞，破碎效果好.超聲法主要利用其對媒介產生的機械振動作用和空化作用達到細胞破碎的目的，但可能由于能量分布不均，功率不足等原因，破壁效果不如預期.液氮法對粘紅酵母的破壁效果較好，但可能由于活性污泥具有菌膠團結構，冷凍破壁效果不明顯.綜上，在兩步法的破壁階段，鹽酸加熱法破壁效果最好，超聲法其次，液氮法最差.
圖 1 兩步法不同破壁方法每克干泥對應脂類提取物質量(a)及FAMEs質量(b)
甲酯化后所得FAMEs產量如圖 1 b所示，可以看出，只有一部分脂類提取物被甲酯化，與其他文獻(Dufreche et al.， 2007; Mondala et al.， 2009)結果類似，原因可能是提取物中含有其他不參與甲酯化的脂類物質.所得FAMEs產量基本與脂類提取物產量成正比，其中，鹽酸加熱法(二氯甲烷提取：(60.4±3.5)mg · g-1，正己烷提?。?45.5±3.2)mg · g-1)與鹽酸加熱超聲法(二氯甲烷提取：(53.2±0.3)mg · g-1，正己烷提?。?43.3±4.1)mg · g-1)有較明顯的優勢，超聲法其次(二氯甲烷提取：(42.7±2.5)mg · g-1，正己烷提?。?38.2±3.9)mg · g-1)，液氮法甲酯化后產量依然很低(二氯甲烷提?。?22.4±4.4)mg · g-1，正己烷提取：(27.3±2.2)mg · g-1).
通過GC-MS分析，兩步法所得FAMEs產物組成成分如表 3所示.鹽酸加熱法、鹽酸加熱超聲法和超聲法所得成分基本相同，共13種，其中，含量較高的包括12-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、棕櫚油酸甲酯(C16 ∶ 1)、棕櫚酸甲酯(C16 ∶ 0)和油酸甲酯(C18 ∶ 1).超聲法所得C18 ∶ 0和C16 ∶ 0兩種脂肪酸甲酯含量較其他方法偏高，原因可能是高能量的超聲波對油脂有一定的破壞作用，促進細菌 細胞偏外側的油脂生成游離脂肪酸從而提高了FAMEs的轉化率.液氮法所得FAMEs含量和種類都很少，表明該方法并不適用于活性污泥細胞壁破碎.在同類研究中所得生物柴油成分多集中于C16~C18，沒有出現過帶支鏈的FAMEs(Dufreche et al., 2007; Mondala et al., 2009; Revellame et al., 2012)，而細菌脂肪酸(尤其是革蘭氏陽性菌)的特點就是很少有雙鍵但常被羥化或者含有支鏈(Sasser，1990)，當細菌處于低溫環境時，細胞膜上的脂肪酸不飽和度會增加，從而增加其低溫流動性.
3.2 油脂提取溶劑對兩步法制備生物柴油的影響
如圖 1a所示，相比于正己烷-甲醇-丙酮，甲醇-二氯甲烷能夠得到更多的脂類提取物，且甲酯化反應后可得到更多生物柴油.采用甲醇-二氯甲烷提取油脂，最高可獲得(60.4±3.5)mg · g-1 的FAMEs，而采用正己烷-甲醇-丙酮溶劑，FAMEs的最高產量為(45.5±3.2)mg · g-1.FAMEs產量與總脂類提取物的比值如圖 2所示，采用二氯甲烷提取，破壁方法為鹽酸加熱法和鹽酸加熱超聲法的比值在0.5左右，超聲法和液氮法的比值在0.75左右，而正己烷提取的方法比值均在0.8以上.結果表明，二氯甲烷提取到了更多無法被甲酯化的物質.有研究表明(Revellame et al., 2012)，采用甲醇-二氯甲烷溶劑不僅從活性污泥中提取到用于生產FAMEs的脂類物質，還能提取出其他高附加值產物，如聚羥基脂肪酸酯(PHAs).該物質是一種天然的高分子生物材料，具有良好的生物相容性能、生物可降解性和塑料的熱加工性能，可作為生物醫用材料和生物可降解包裝材料，但目前其相對于傳統塑料的高價格束縛了它的應用領域.在實際應用中，如果只是單純制備FAMEs，可以考慮采用正己烷-甲醇-丙酮油脂提取溶劑;如果采用甲醇-二氯甲烷油脂提取溶劑，不僅能保證FAMEs的制備，還可能提取制備出多種高附加值產物.
?圖 2 FAMEs產量與脂類提取物產量比值
在FAMEs成分上，兩種溶劑組合沒有明顯差異(表 3).組分中都包括以下帶甲基支鏈的脂肪酸甲酯：9-甲基十四烷酸甲酯、12-甲基十三烷酸甲酯、12-甲基十四烷酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、14-甲基十六烷酸甲酯;不飽和脂肪酸甲酯：棕櫚油酸甲酯(C16 ∶ 1)和油酸甲酯(C18 ∶ 1).只是在采用液氮冷凍破壁的情況下，相對于甲醇-二氯甲烷，正己烷-甲醇-丙酮提取油脂使其甲酯化后，無法檢測到9-甲基十四烷酸甲酯、油酸甲酯(C18 ∶ 1)及硬脂酸甲酯(C18 ∶ 0).Knothe(2005)對生物柴油的研究中指出，生物柴油一般低溫流動性差，低溫容易結晶，堵塞過濾器，導致不能從油箱泵送到發動機，造成無法啟動，嚴重制約了生物柴油的使用，而脂肪酸甲酯中雙鍵和支鏈數目的增加，能夠增大分子間距，在一定程度上增加其低溫流動性，但不飽和鍵過多會導致生物柴油的抗氧化能力變弱.
3.3 破壁方法對一步法制備生物柴油的影響
一步法每克干泥所得FAMEs質量如圖 3所示，一步法中超聲法產量最高，FAMEs產量為(45.5±3.2)mg · g-1，普通法其次，FAMEs產量為(40.7±0.7)mg · g-1，鹽酸法和鹽酸超聲法產量較低，分別為(29.8±4.3)mg · g-1和(33.4±2.6)mg · g-1，液氮法最低，產量為(27.2±4.2)mg · g-1.在一步法中，硫酸是關鍵的因素，它不但是酯化反應的催化劑，而且可以將一些脂肪酸鹽轉化為脂肪酸參與酯化反應，同時硫酸有很好的破壞細胞壁效果，本實驗中用到的體積比為5%的硫酸-甲醇在同類實驗中屬于較高的濃度，可兼顧破壁和甲酯化反應，因此，普通法也可以得到比較高的脂肪酸甲酯產量.Pastore等(2013)的研究表明，在甲酯化反應中，在一定范圍內硫酸的濃度越高，得到的脂肪酸甲酯的量也就越大.實驗結果表明，超聲法有助于提高產量，而鹽酸法和鹽酸超聲法反而降低了脂肪酸甲酯的產量.這很可能是因為酯化反應為可逆反應，鹽酸含有較多的水，促使甲酯化反應向相反方向移動，即水會和甘油酯或脂肪酸甲酯反應生成游離脂肪酸，降低脂肪酸甲酯產率.因此，盡管鹽酸法和鹽酸超聲法有比較強的破壁效果，但并不適用于一步法.
?圖 3 一步法不同破壁方法每克干泥對應的FAMEs質量
一步法脂肪酸甲酯產物組成如表 4所示，幾種破壁方法的甲酯化產物組成基本一致，同樣出現了上述5種含有甲基支鏈的脂肪酸甲酯及2種單不飽和脂肪酸甲酯.但在沒有破壁處理的酯化反應后，沒有檢測到12-甲基十三烷酸甲酯，而采用鹽酸加熱超聲法和液氮法破壁后，則無法檢測到硬脂酸甲酯(C18 ∶ 0).總體而言，在成分上與采用鹽酸加熱或鹽酸加熱超聲破壁的兩步法基本一致.
3.4 甲酯化方案對生物柴油制備的影響
對一步法和兩步法中脂肪酸甲酯產量最高的兩種制備方法(即超聲一步法和鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取兩步法)進行比較，鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取兩步法可以得(60.4±3.5)mg · g-1生物柴油，超聲一步法可以得到(45.5±3.2)mg · g-1生物柴油，兩步法產量明顯高于一步法，在脂肪酸甲酯組成上兩種方法沒有明顯差別.鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取這種方法在制備生物柴油量上有明顯優勢，而超聲一步法雖然產量稍低，但制備步驟相對簡單，所用化學試劑較少，也不失為一種實用且相對環境友好的生物柴油制備方法.在實際工程應用中應根據具體情況，綜合考慮各種因素，選取最適合的剩余污泥制備生物柴油方法.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
4 結論
1)制備生物柴油兩步法中采用鹽酸加熱破壁的效果最好，而制備生物柴油一步法則是采用超聲破壁的產量最高.
2)采用甲醇-二氯甲烷溶劑提取油脂，相比正己烷-甲醇-丙酮溶劑能夠得到更多脂類物質及較高的生物柴油產量.
3)鹽酸破壁配合甲醇-二氯甲烷提取的兩步法在制備生物柴油產量上有明顯優勢，超聲破壁一步法雖產量偏低，但因其步驟簡單，化學試劑用量少，在大規模生產中也有很好的應用價值.
4)不同的甲酯化方案對脂肪酸甲酯成分的影響不大，出現的帶支鏈的細菌脂肪酸甲酯和不飽和脂肪酸甲酯很可能對改善生物柴油的低溫流動性有一定的意義.
