好氧顆粒污泥具有沉降性能好、 污泥濃度高，易于固液分離，便于提高污水處理效率，降低污水處理成本等優(yōu)點(diǎn)[1]而備受關(guān)注. 由于其特殊的顆粒球狀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了污泥內(nèi)外形成溶解氧(DO)濃度差，這便為好氧顆粒污泥工藝能夠?qū)崿F(xiàn)同步去除COD、 氮和磷提供了合適的條件[2]. 據(jù)報(bào)道，DO是影響污水生物脫氮除磷的影響的關(guān)鍵因素之一[3]，過低的DO會(huì)影響其硝化速率，易導(dǎo)致亞硝態(tài)氮積累，從而影響系統(tǒng)除磷效果; 而過高的DO又會(huì)致使反應(yīng)器出水硝態(tài)氮含量過高，并且能耗較大[4]. 雖然低DO有利于污泥系統(tǒng)同步硝化反硝化的形成[2]，但是關(guān)于低DO下，好氧顆粒污泥(AGS)系統(tǒng)處理生活污水同步脫氮除磷的長期運(yùn)行特征至今報(bào)道不多; 關(guān)于好氧顆粒污泥中的生物種群構(gòu)成，尤其是處理低COD/N比生活污水好氧顆粒系統(tǒng)中生物種群結(jié)構(gòu)分析，更是鮮見報(bào)道. 一些研究學(xué)者采用原位熒光雜交技術(shù)(FISH)研究污水處理系統(tǒng)中脫氮除磷菌群的構(gòu)成[5, 6]; 還有學(xué)者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)分析反應(yīng)器中的生物種群的演變特征及主要菌群[7]等. 然而，以前的研究由于缺乏高通量技術(shù)分析結(jié)果，其結(jié)果僅限于氨氧化細(xì)菌(AOB)和亞硝化細(xì)菌(NOB)等個(gè)別菌群的分析，而缺乏相對完整的顆粒污泥系統(tǒng)生物種群構(gòu)成信息. 了解生物反應(yīng)器內(nèi)主要功能菌群的構(gòu)成有利于了解生化反應(yīng)和工藝調(diào)控[8]. 近年來具有低成本、 高通量、 自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)的高通量測序技術(shù)逐漸發(fā)展起來，該技術(shù)能一次對多達(dá)幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定，同時(shí)也可以對一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致的分析[9]. 并且該技術(shù)已經(jīng)開始在污水處理系統(tǒng)中用于種群結(jié)構(gòu)分析[10]. 因此，本實(shí)驗(yàn)在序批式活性污泥反應(yīng)器中(SBR)接種好氧顆粒污泥(AGS)，構(gòu)建成AGS-SBR系統(tǒng)，主要研究該系統(tǒng)在低DO下，處理低COD/N比生活污水的同步脫氮除磷的長期穩(wěn)定運(yùn)行特性，并采用高通量測序技術(shù)解析穩(wěn)定運(yùn)行期間的主要菌群構(gòu)成，以期為該工藝應(yīng)用于處理低COD/N比生活污水的實(shí)際工程及工藝調(diào)控提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù).1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行方式

　　實(shí)驗(yàn)裝置采用序批式活性污泥反應(yīng)器(SBR)如圖 1所示. 反應(yīng)器由有機(jī)玻璃制成，高20 cm，長10 cm，有效容積為1.5 L. 反應(yīng)器上部和下部設(shè)置了排水口和取樣口，采用空氣壓力機(jī)通過底部的沙盤曝氣頭進(jìn)行曝氣，轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制氣體流量. 將反應(yīng)器置于恒溫水浴鍋中，使其反應(yīng)溫度保持在30℃左右. 反應(yīng)器每天運(yùn)行兩個(gè)周期，每個(gè)周期720 min： 進(jìn)水5 min、 曝氣360 min、 沉淀5 min、 排水5 min、 余下345 min為閑置. 每周期排水為反應(yīng)器有效容積的50%. 通過轉(zhuǎn)子流量計(jì)控制反應(yīng)器的曝氣量，從而控制溶解氧(DO)濃度為0.5-1.0mg ·L-1. 根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行排泥，使反應(yīng)器內(nèi)污泥齡約為20 d.

　　圖 1 SBR實(shí)驗(yàn)裝置示意

　　1.2 接種污泥和實(shí)驗(yàn)用水

　　接種污泥為本課題組前期同步脫氮除磷工藝成功啟動(dòng)后60 d的好氧顆粒污泥，其直徑大約為0.6-1.5 mm，顏色為黃色，污泥體積指數(shù)SVI=55.22 mL ·g-1,實(shí)驗(yàn)用水為人工配制的模擬生活污水[11]. 葡萄糖、 檸檬酸三鈉為碳源，(NH4)2SO4為氮源，KH2PO4為磷源，反應(yīng)器啟動(dòng)運(yùn)行期，加入40 mg ·L-1 Ca2+以及微量Fe2+、 Cu2+等離子，NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.5-8.0，主要水質(zhì)指標(biāo)ρ(COD)為200-300mg ·L-1， ρ(TN)為50-60mg ·L-1，ρ(TP)為2-3.5mg ·L-1.

　　1.3 實(shí)驗(yàn)分析方法1.3.1 污泥樣品采集及測序?qū)嶒?yàn)流程

　　取自AGS-SBR穩(wěn)定運(yùn)行期的污泥樣品，首先，采用淤泥基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)，根據(jù)說明書提取樣品DNA，并將DNA提取物放在-20℃條件下保存. 然后，對16S rRNA的V3、 V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物338F： 5′-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3′，806R： 5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′. PCR條件： 95℃預(yù)變性2 min，然后執(zhí)行95℃變性30 s、 55℃退火 30 s、 72℃ 延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，最后再72℃退火5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物保持在4℃條件下. 樣本按照正式實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行，樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖電泳檢測，采用 AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測; 然后，參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，取合適的濃度進(jìn)行EmPCR(平行擴(kuò)增)，用Illumina Miseq系統(tǒng)測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司). 所得結(jié)果進(jìn)行過濾處理，得到優(yōu)化序列; 對優(yōu)化序列在97%相似度水平進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析，分析樣品的多樣性以及群落結(jié)構(gòu)[10, 12].

　　1.3.2 水質(zhì)和污泥指標(biāo)分析

　　實(shí)驗(yàn)期間，水體COD、 NH4+-N、 TN、 NO3--N、 NO2--N和TP以及污泥MLSS、 SVI指標(biāo)均按國標(biāo)法測定[13]; 污泥形態(tài)觀察、 DO、 pH值測定均按照參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行.

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 AGS-SBR除污性能的長期穩(wěn)定運(yùn)行特征

　　在AGS-SBR反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行的180d里，反應(yīng)器對污水COD、 氨氮、 TN、 TP的去除情況以及出水NO3--N和NO2--N的濃度情況如圖 2所示. 進(jìn)水COD濃度在178.56-267.51 mg ·L-1之間波動(dòng)，出水COD濃度為14.97-46.08 mg ·L-1，平均出水濃度為29.08 mg ·L-1. 整個(gè)運(yùn)行期間，反應(yīng)器對COD的去除效果始終保持較高的水平，平均去除率為87.17%[圖 2(a)]. 反應(yīng)器對NH4+-N的去除情況如圖 2(b)所示，進(jìn)水的NH4+-N濃度波動(dòng)較大，為49.52-70.12 mg ·L-1，平均進(jìn)水濃度為59.43 mg ·L-1. 運(yùn)行期間，由于轉(zhuǎn)子流量計(jì)的不穩(wěn)定，使得反應(yīng)器內(nèi)的DO濃度有一定的波動(dòng)，因此導(dǎo)致了出水NH4+-N濃度及其去除率稍微有一些波動(dòng)，整個(gè)反應(yīng)器運(yùn)行期間，出水NH4+-N濃度最高達(dá)7.21 mg ·L-1，但其平均出水濃度為2.83 mg ·L-1，平均去除率為95.21%. 同時(shí)，反應(yīng)器運(yùn)行過程中，出水NO3--N、 NO2--N的積累情況見圖 2(c). 雖然實(shí)驗(yàn)過程中，由于轉(zhuǎn)子流量計(jì)的不穩(wěn)定，導(dǎo)致反應(yīng)器內(nèi)曝氣量的略有波動(dòng)，使得出水NO3--N和NO2--N的濃度有一些小的變化，但通過及時(shí)對流量計(jì)進(jìn)行微調(diào)，控制反應(yīng)器內(nèi)DO濃度的穩(wěn)定，整個(gè)反應(yīng)器運(yùn)行期間，反應(yīng)器出水NO3--N和NO2--N的濃度不高，平均濃度分別為3.48mg ·L-1和3.24mg ·L-1. 反應(yīng)器對污水中的TN和TP的去除效果呈逐步穩(wěn)定趨勢[圖 2(d)和圖 2(e)]. 反應(yīng)器平均進(jìn)水TN濃度為60.12 mg ·L-1，平均出水濃度為13.26mg ·L-1，平均去除率為77.05% [圖 2(d)]. 而進(jìn)水TP濃度在2.03-3.62 mg ·L-1內(nèi)波動(dòng)，平均進(jìn)水濃度為2.98 mg ·L-1，但出水一直保持穩(wěn)定. 運(yùn)行過程中，曝氣量的波動(dòng)對反應(yīng)器內(nèi)的除磷菌的活性沒有影響，因此反應(yīng)器內(nèi)的除磷效果始終保持在較為穩(wěn)定的狀態(tài)，TP最高出水濃度為0.44 mg ·L-1，平均出水濃度為0.26 mg ·L-1，平均去除率為91.11% [圖 2(e)]. 本實(shí)驗(yàn)的研究表明，對于AGS-SBR同步脫氮除磷工藝來講，在工程應(yīng)用上要嚴(yán)格控制曝氣量，使DO濃度在0.5-1.0mg ·L-1之間，可保證反應(yīng)器內(nèi)微生物對氮素和TP的最高去除能力. AGS-SBR系統(tǒng)內(nèi)，好氧顆粒污泥自身的特殊結(jié)構(gòu)，以及低DO的運(yùn)行方式，使得反應(yīng)器內(nèi)同時(shí)存在著好氧菌和厭氧菌，為TN和TP的去除起到了良好的促進(jìn)作用.

　　圖 2 AGS-SBR反應(yīng)器對COD、 氨氮、 TN和TP的去除情況及出水NO3--N和NO2--N的變化

　　2.2 AGS-SBR污泥性能變化分析

　　AGS-SBR反應(yīng)器內(nèi)MLSS及污泥體積指數(shù)(SVI)的變化如圖 3所示. 反應(yīng)器啟動(dòng)初期接種的好氧顆粒污泥MLSS和SVI分別為3.02 g ·L-1和49.52 mL ·g-1，在以后穩(wěn)定運(yùn)行的180d里，污泥的MLSS和SVI值雖有一定的波動(dòng)，但是變化不是很明顯，其MLSS和SVI值平均分別為3.24 g ·L-1和41.32 mL ·g-1，較反應(yīng)器啟動(dòng)初期接種的好氧顆粒污泥，反應(yīng)器污泥濃度MLSS略有增加，而SVI值略有減少. 表明反應(yīng)器運(yùn)行整個(gè)期間，AGS-SBR系統(tǒng)內(nèi)的好氧顆粒污泥沉降性能一直很好，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性. 同時(shí)，對第0、 40、 60、 100、 140和180 d的反應(yīng)器中好氧顆粒污泥形態(tài)進(jìn)行觀察，如圖 4所示. 顆粒污泥在整個(gè)運(yùn)行期間，其外觀沒有明顯變化，6個(gè)不同運(yùn)行時(shí)間的顆粒污泥均呈現(xiàn)出外形規(guī)則、 邊緣較平整，顆粒結(jié)構(gòu)緊密等特征，并沒有出現(xiàn)明顯的顆粒污泥解體的現(xiàn)象. de Kreuk等[14]曾報(bào)道當(dāng)DO小于3.0-4.0 mg ·L-1，能引起顆粒污泥的解體. 和以前的研究報(bào)道相比[15]，本實(shí)驗(yàn)中，低DO條件下，AGS-SBR系統(tǒng)表現(xiàn)出良好的脫氮除磷及顆粒污泥穩(wěn)定性. 原因在于，本研究反應(yīng)器進(jìn)水屬于低基質(zhì)生活污水，有利于生長速率較慢的硝化細(xì)菌、 聚磷菌PAOs的富集[16]，從而導(dǎo)致顆粒污泥生長速率變慢，MLSS增長較低. 本實(shí)驗(yàn)中，即使是在較低DO下(0.5-1.0mg ·L-1)，AGS-SBR系統(tǒng)中好氧顆粒污泥運(yùn)行180 d后仍然保持良好的完整性和沉降性能. 同時(shí)，本研究中，處理低碳氮比生活污水的AGS-SBR系統(tǒng)所需要的DO濃度比其他的AGS-SBR污水處理系統(tǒng)大約低60%～70%[17]. 可見，AGS-SBR是一種低能耗、 無需外加碳源、 高效處理低COD/N比生活污水的脫氮除磷工藝.

　　圖 3 運(yùn)行階段反應(yīng)器中顆粒污泥MLSS與SVI的變化情況

　　圖 4 運(yùn)行階段顆粒污泥的形態(tài)變化

　　2.3 AGS-SBR的主要菌群

　　本研究中，AGS-SBR系統(tǒng)對污水TN 和 TP的平均去除率分別達(dá)到77.05%和91.11%，污水處理系統(tǒng)表現(xiàn)出的除污性能主要和系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢微生物菌群的構(gòu)成密切相關(guān). 為了進(jìn)一步深入了解低DO下，好氧顆粒污泥工藝表現(xiàn)出良好的脫氮除磷效果的微生物學(xué)機(jī)理，因此對AGS-SBR反應(yīng)器內(nèi)穩(wěn)定期間的微生物菌群進(jìn)行解析. AGS-SBR系統(tǒng)中好氧顆粒污泥中的細(xì)菌種群構(gòu)成如圖 5所示(門水平). 污泥的主要菌群為：變形菌門(Proteobacteria，相對豐度為66.91%)、 厚壁菌門(Firmicutes，相對豐度為21.64%)、 綠菌門(Chlorobi，相對豐度為2.65%)、 綠彎菌門(Chloroflexi，相對豐度為2.09%)、 擬桿菌門(Bacteroidetes，相對豐度為1.85%)、 放線菌門(Actinobacteria，相對豐度為0.7%)和浮霉菌門(Planctomycetes，相對豐度為0.13%). 其中變形菌門菌群所占比重最大，其次是厚壁菌門(Firmicutes)，再者是綠菌門(Chlorobi)、 綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等. 同時(shí)，表 1列出了反應(yīng)器穩(wěn)定運(yùn)行期顆粒污泥樣品屬水平上，被鑒定出的氨氧化菌(AOB)、 亞硝酸氧化菌(NOB)、 反硝化菌和除磷菌.

　　圖 5 污泥樣品微生物菌群的相對豐度(門水平)

　　表 1 屬水平上，被鑒定出的氨氧化菌(AOB)、 亞硝酸氧化菌(NOB)、 反硝化菌和除磷菌及其豐度

　　2.4 AGS-SBR脫氮除磷機(jī)制討論

　　有研究報(bào)道，變形菌門菌群(Proteobacteria)是城鎮(zhèn)污水處理廠活性污泥系統(tǒng)和廢水生物反應(yīng)系統(tǒng)的主要種群，包含多種代謝種類，在降解有機(jī)物的同時(shí)完成脫氮除磷的功能[18]. 厚壁菌門(Firmicutes)中的芽孢桿菌綱(Clostridia)可能與COD及難以分解的大分子有機(jī)物的降解有關(guān)[19]. 綠彎菌門(Chloroflexi)常存在于污泥菌膠團(tuán)絮狀體內(nèi)部，并以絮體骨架的形式存在，這為好氧顆粒污泥的結(jié)構(gòu)提供了骨架支撐[20]. Kragelund等[21]在對活性污泥中綠彎菌門(Chloroflexi)的種類、 豐度和生態(tài)生理學(xué)的研究中也發(fā)現(xiàn)，綠彎菌門(Chloroflexi)具有較好的生物除磷作用. Hill等[22]發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(Bacteroidetes)具有非常強(qiáng)的營養(yǎng)物質(zhì)代謝能力，如復(fù)雜有機(jī)物、 蛋白質(zhì)和脂類等. Li等[23]在污水處理系統(tǒng)剩余污泥減量化及微生物菌群演變的研究中發(fā)現(xiàn)，擬桿菌門(Bacteroidetes)具有水解污泥絮體的作用. 本研究中，上述生物種群構(gòu)成了AGS-SBR系統(tǒng)好氧顆粒污泥的主要生物種群，它們對廢水中的COD、 氨氮、 TN和TP的去除起著重要作用，這和反應(yīng)器表現(xiàn)出良好的同步脫氮除磷性能密切相關(guān). 另外，本研究中，顆粒污泥樣品中也檢測到了少量的浮霉菌門(Planctomycetes). 在浮霉菌門(Planctomycetes)存有一些菌屬具有厭氧氨氧化功能[24]，但環(huán)境中仍存在未鑒定的新菌種. 該類菌群能在厭氧的條件下，以NH4+-N、 NO2--N分別為電子供體和受體，反應(yīng)生成氣態(tài)氮，從而達(dá)到生物脫氮的目的. 本實(shí)驗(yàn)中，由于進(jìn)水COD/N比較低，并且反應(yīng)器在較低DO條件下運(yùn)行，檢測出來的浮霉菌門(Planctomycetes)種群中有可能存在著厭氧氨氧化功能的菌群.

　　再者，通過對反應(yīng)器內(nèi)主要脫氮除磷功能菌群的分析(表 1)可以看出，顆粒污泥樣品中梭菌屬(Clostridium)相對豐度最高，高達(dá)21.24%. 曾有文獻(xiàn)報(bào)道，Clostridium是一類具有反硝化除磷功能的菌群[25]. 黃榮新等[26]在SBR反應(yīng)器中進(jìn)行反硝化聚磷菌(DPB)強(qiáng)化富集，也分離得到了高效反硝化除磷菌屬Clostridium. 這類反硝化聚磷菌(DPB)，可以在缺氧環(huán)境下以NOx-為電子受體，利用內(nèi)碳源，通過“一碳兩用”方式實(shí)現(xiàn)反硝化脫氮的同時(shí)過量聚磷. 目前報(bào)道最多的聚磷菌(PAOs)按其菌屬可劃分為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、 氣單胞菌屬(Aeromonas)、 棒桿菌屬 (Corynebacterium)、 腸球菌屬 (Enterococcus)等[27]. 但是本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中并沒有監(jiān)測出已經(jīng)報(bào)道的這四類聚磷菌. 而是檢測出具有反硝化除磷功能的一類菌群梭菌屬(Clostridium). 同時(shí)，反應(yīng)器中存在厭氧繩菌屬(Anaerolinea)細(xì)菌，屬于綠彎菌門(Chloroflexi)中的一類，是和除磷性能有關(guān)的一類菌群[21].

　　同時(shí)，AGS-SBR反應(yīng)器內(nèi)存在著多種與脫氮有關(guān)的菌群. Denitratisoma是紅環(huán)菌科(Rhodocyclaceae)的一個(gè)新屬，是Fahrbach等[28]從城市污水處理廠的活性污泥中分離得到的，是一類新型的具有好氧反硝化能力的菌群，能直接將亞硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮[8]; 陶厄氏菌屬(Thauera)是近年來才被定義的一個(gè)屬，廣泛分布于污水處理系統(tǒng)中，在污水處理系統(tǒng)、 污泥和土壤環(huán)境中生長良好[29]，大都為桿狀且具有好氧反硝化能力[30]. 此外，反應(yīng)系統(tǒng)中存在少量的毛球菌屬(Comamonas)和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，這些菌群是和好氧反硝化能力有關(guān)的脫氮菌群[31]. 由于AGS-SBR系統(tǒng)長期在低DO條件下進(jìn)行，反應(yīng)器中存在著好氧、 缺氧和厭氧的微環(huán)境，反應(yīng)器內(nèi)可能存在自養(yǎng)反硝化、 好氧反硝化、 厭氧氨氧化等多種脫氮途徑. 但從表 1可知，Denitratisoma的相對豐度較高，表明反應(yīng)器內(nèi)以好氧反硝化為主的方式進(jìn)行脫氮; 而氨氧化菌(AOB)、 亞硝酸氧化菌(NOB)和Planctomycetaceae等含量較低，說明反應(yīng)器中存在自養(yǎng)反硝化、 短程脫氮、 厭氧氨氧化等多種脫氮途徑，但不在反應(yīng)器中占據(jù)主導(dǎo)地位. 綜上，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析初步判斷，低DO條件，AGS-SBR反應(yīng)器中Clostridium、 Anaerolinea 和Denitratisoma相對豐度較高，導(dǎo)致了反應(yīng)系統(tǒng)具有良好的脫氮除磷性能.具體參見污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1)在反應(yīng)器運(yùn)行的180 d里，AGS-SBR系統(tǒng)表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定運(yùn)行特征，對COD、 NH4+-N、 TN和TP的平均去除率分別為87.17%、 95.21%、 77.05% 和91.11%，平均出水濃度穩(wěn)定在29.08、 2.83、 13.26和0.26mg ·L-1; NO--N和NO3--N的平均積累量分別為3.48mg ·L-1和3.24mg ·L-1.

　　(2) AGS-SBR反應(yīng)器運(yùn)行期間，系統(tǒng)平均污泥濃度MLSS為3.24 g ·L-1，SVI值平均為41.32 mL ·g-1，好氧顆粒污泥始終保持著完整的外觀和密實(shí)緊湊的結(jié)構(gòu)，并沒有出現(xiàn)明顯的顆粒污泥解體的現(xiàn)象. AGS-SBR系統(tǒng)是一種低能耗、 無需外加碳源、 高效處理低COD/N比生活污水的脫氮除磷工藝.

　　(3) 高通量測序結(jié)果表明，變形菌門(Proteobacteria)、 厚壁菌門(Firmicutes)、 綠菌門(Chlorobi)、 綠彎菌門(Chloroflexi)和擬桿菌門(Bacteroidetes)為SBR-AGS反應(yīng)器中主要優(yōu)勢菌群. 好氧顆粒污泥中，Denitratisoma、 Planctomycetaceae、 Thauera、 Comamonas、 Nitrosomonas和Nitrospira是反應(yīng)器中與脫氮有關(guān)菌群，而Clostridium和 Anaerolinea 是和除磷相關(guān)的菌群.