1 引言
污水處理廠二沉池中常出現泥水分離效果較差的現象，造成大量污泥流失和出水水質惡化.胞外聚合物(extracellular polymeric substances，EPS)的組成、污泥表面特性以及絮體粒徑分布都是影響活性污泥絮凝沉降能力的重要因素.EPS是指附著在細胞壁外用于自我保護，并在饑餓環境下為細菌提供碳源和能量的高分子聚合物，是活性污泥絮體的重要組成部分.EPS由細胞自身分泌物、細胞溶解物以及水中的微小顆粒組成，可分為緊密粘附胞外聚合物(tightly bound EPS，TB-EPS)和松散附著胞外聚合物(loosely bound EPS，LB-EPS)兩部分.
有研究發現異養菌為主的活性污泥中LB-EPS含量越多，污泥的沉降和絮凝性能越差，TB-EPS對污泥的沉降和絮凝性能基本無影響.然而另一些研究表明，活性污泥絮體內，TB-EPS含量相較于LB-EPS含量更多，且絮凝性能更強，因此TB-EPS的絮凝特性可直接反映活性污泥的絮凝特性.Liu等根據DLVO理論對LB-EPS和TB-EPS進行分析后發現，相較于LB-EPS，TB-EPS對異養污泥絮凝性能的影響更大.產生這些截然不同結論的原因可能是活性污泥中的微生物相的不同所致.針對以自養菌為主的活性污泥中EPS對污泥絮凝特性影響的研究尚鮮有報道.李志華等在研究自養菌對顆粒污泥穩定性影響的過程中發現，以EPS為骨架的自養顆粒污泥相較于以絲狀菌為骨架的異養菌顆粒污泥更能保持長期穩定狀態，而Liang等關于絮狀自養活性污泥EPS的提取方法對比的過程中僅給出了EPS的分層結構及各層含量的多少，并未就EPS與自養活性污泥絮凝沉降特性的相關性作進一步研究.由于自養活性污泥中細菌種類單一，無絲狀菌存在，所形成的污泥性狀相較于異養活性污泥更穩定.因此，有必要就自養和異養活性污泥LB-EPS和TB-EPS的組成及其對活性污泥絮凝特性的影響作深入探討.
2 材料與方法
?2.1 試驗裝置
采用3個透明有機玻璃制成的SBR反應器培養污泥，工作容積為20 L.由電磁空氣泵供氧，機械攪拌速度為35 r · min-1.以轉子流量計控制溶解氧(DO)濃度.通過反應器外層的循環水浴使溫度維持在25 ℃.運行方式為12 h 1個周期，即進水15 min，攪拌180 min，曝氣480 min，沉淀30 min，排水15 min.沉淀結束后排出10 L廢水，補充等量人工模擬廢水進入下一周期.
2.2 進水水質及接種污泥
3個反應器A、B、C的有機負荷分別為0、0.30、0.74 kg · kg-1 · d-1.反應器A為實驗室培養的全自養硝化污泥，已穩定運行4年.反應器B、C中的接種污泥來自西安市某污水處理廠二沉池回流污泥.3個反應器均投加人工配制廢水，氨氮濃度為200 mg · L-1，由NH4Cl提供.主要成分如下：NH4Cl 764.3 mg · L-1，K2HPO4175.6 mg · L-1，MgSO4 60 mg · L-1，CaCl218 mg · L-1以及微量元素溶液0.38 mL · L-1.微量元素溶液成分如下：FeCl3·6H2O 375 g · L-1，MnCl2·4H2O 30 g · L-1，ZnSO4·7H2O 30 g · L-1，H3BO3 37.5 g · L-1，CuSO4·5H2O 7.5 g · L-1，KI 4.5 g · L-1，EDTA 2500 g · L-1.采用結晶乙酸鈉作為碳源，通過改變其投加量來控制有機負荷，維持所有反應器混合液懸浮固體濃度(MLSS)在3000 mg · L-1，污泥齡(SRT)為20 d，保持DO不小于2.0 mg · L-1，pH為7.5~8.0.
經3個月培養馴化，反應器B、C中COD和氨氮去除率均達到90% 以上，污泥沉降特性良好.經PCR實時定量測定，由單一氮源培養的反應器A中總細菌數為0.5×107 cells · g-1，其中硝化細菌主要為歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonas europaea)，占細菌總數的95.97%，反應器B、C中總細菌數分別為1.17×108 cells · g-1和1.40×108 cells · g-1，其中硝化細菌占細菌總數的9.75%和9.61%.用于進行EPS含量和物化特性分析的污泥，分別取自3個反應器運行周期曝氣停止前2 min.
2.3 EPS的提取及成分分析
LB-EPS和TB-EPS的提取采用改良的兩階段熱提法.污泥含固率采用105 ℃烘干法測定，EPS總量用溶解性有機碳(TOC)表示，采用TOC-L總有機碳分析儀(Shimadzu，Japan)測定，EPS中多糖采用蒽酮法測量，標準物質為葡萄糖;蛋白質采用 Folin-酚法測量，標準物質為牛血清蛋白;DNA采用二苯胺顯色法測定，標準物質為小牛胸腺DNA.
2.4 分析項目與檢測方法
2.4.1 三維熒光光譜分析
EPS三維熒光光譜(three-dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopy，3DEEM)采用FP 6500 熒光分光度計(JASCO，Japan)測定，使用氙弧燈為激發光源;激發波長λex=220~400 nm，發射掃描波長λem=220~500 nm;激發與發射的狹縫寬度均為5 nm;激發波長的掃描間隔為10 nm;掃描速度為1200 nm · min-1.將所提取的不同污泥的LB-EPS和TB-EPS直接進行三維熒光掃描，用Spectra Manager軟件進行數據分析.
2.4.2 污泥絮體結構和微生物相
以90i光學顯微鏡(NIKON，Japan)觀察不同污泥以及分別提取LB-EPS和TB-EPS后污泥的絮體結構.采用JSM-6510LV掃描電子顯微鏡(JEOL，Japan)對預處理后的污泥內部結構進行觀察，預處理方法如下：取少量污泥樣品與4%多聚甲醛混合，在4 ℃下固定24h，固定好的污泥樣品用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液依次洗脫15 min，然后放入乙醇：乙酸異戊酯=1∶1溶液和100%乙酸異戊酯溶液中各置換5 min，去掉上清液倒入干凈培養皿中自然干燥.
采用iQ5實時定量PCR(BIO- RAD，USA)對所培養的活性污泥中的微生物相進行定量分析.AOB的引物為：amoA-1F(5′-GGG GTT TCT ACT GGT GGT)和amoA-2R(5′-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC)，目的片段長：491 bp.用于克隆的PCR擴增采用25 μL體系.用于末端限制性片段長度多態性分析(T-RFLP)的PCR擴增采用50 μL體系.PCR體系包括10～20 ng的DNA模板，1x PCRbuffer，2.5 mmol · L-1MgCl2，0.2 mmol · L-1 的dNTPs，0.5 μmol · L-1的上下游引物，1.0U的Taq DNA聚合酶.PCR反應的退火溫度為55 ℃.
2.4.3 污泥表面性質測定
污泥表面電荷量采用Zeta電位表征.原污泥以及依次提取LB-EPS和TB-EPS后污泥的Zeta電位采用Malvern Zatasizer Nano ZS90(Malvern Instruments，UK)進行分析測定.
采用相對疏水性(relative hydrophobity，RH)表征原污泥絮體以及提取LB-EPS和TB-EPS之后污泥絮體疏水性能的變化.RH的計算公式如下，
式中，MLSSe表示經過正十六烷乳化后水相中混合液懸浮固體濃度，MLSS0表示原污泥中懸浮固體濃度，正十六烷與污泥混合液體積比為1∶1.
2.4.4 污泥絮凝性能測定
采用污泥絮體重新絮凝能力(reflocculation ability，FA)與出水濁度表征污泥絮體的絮凝能力.濁度采用Model 2100 AN濁度儀(HACH，USA)測定.FA的計算公式如下，
式中，A為經過30 s超聲波和2 min離心處理后的污泥樣品上清液吸光度，B為經過30 s超聲波2 min離心處理后、再進行60 r · min-1磁力攪拌15 min和2 min離心后的污泥樣品上清液吸光度.
3 結果與討論
3.1 EPS的組分及含量分析
如圖 1所示，不同污泥的LB-EPS與TB-EPS中蛋白質與多糖都是其主要組成部分，DNA所占比例較小.污泥A中EPS總量及蛋白質含量明顯高于B、C，這一結果與所報道的在自養菌顆粒污泥中EPS含量高于顆粒污泥中EPS含量的結果相一致.分析其原因：水中有機質的去除主要是酶的氧化分解作用所造成，細菌等生物對它的吸附所做的貢獻相對較小，由細胞自身代謝產物所構成的EPS中含有一定量胞外酶，可用于有機質的氧化分解.一方面，不同有機負荷時反應器中微生物所處的生長階段不同，低有機負荷時，細菌進入減衰增殖后期及內源呼吸期，此時微生物的生長速率低，內源呼吸率較高，大量的細菌發生自溶，釋放出胞內聚合物，使EPS含量增加.另一方面污泥B、C的進水中COD含量較高，在降解有機物的過程中會消耗大量胞外酶，造成EPS中蛋白質含量降低.而自養活性污泥中死細胞很少，僅占細胞總數的11%，可降解有機物含量極低，對于胞外酶的消耗也非常少，因此污泥A的EPS中蛋白質含量相對較高.另外，由圖 1還可看出，隨有機負荷的增加，TB-EPS及多糖含量也增加.這是因為在高有機負荷條件下，碳源過于充足，細菌無法及時充分利用，從而將過剩的碳源轉化為多糖類EPS，使EPS中多糖含量增加.污泥A、B、C的TB-EPS含量均占EPS總量的75%以上，其含量變化將直接導致EPS總量的變化.可見有機負荷對EPS的組分與含量有明顯的影響，有機負荷越高，多糖含量越多，EPS總量及蛋白質含量越少.
圖 1 不同污泥TB-EPS和LB-EPS組分及含量的差異
3.2 EPS的三維熒光光譜分析
由于EPS成分復雜，僅通過化學測定并不能完全了解EPS中各組分、含量的變化.三維熒光光譜能夠分析EPS中帶有熒光性質的芳香族結構和不飽和脂肪酸，因此可以進一步為EPS成分的結構、官能團和種類提供信息.EPS中所存在的溶解態有機物質的熒光峰的位置可以歸納為：(1)Peak a：Ex/Em=280~285/340~350 nm;(2)Peak b：Ex/Em=350~365/440~460 nm;(3)Peak c：Ex/Em=225/340~350nm;(4)Peak d：Ex/Em=300~330/380~420 nm.其中(1)、(3)均屬于類蛋白熒光，與芳環氨基酸結構有關，(1)為類色氨酸熒光峰，(3)為類酪氨酸熒光峰;(2)為可見區類腐殖酸熒光峰;(4)為可見區類富里酸熒光峰，與胞外聚合物中的羧基與羰基結構有關.
圖 2是不同污泥LB-EPS與TB-EPS的三維熒光光譜圖.由圖 2可以看出，同一污泥的LB-EPS與TB-EPS不僅在濃度上存在差別，熒光特性上也不完全相同，位于內層的TB-EPS含有較多物質并且濃度更高.不同污泥的LB-EPS與TB-EPS中均存在Peak a，Peak b，Peak c 3個熒光峰，從熒光強度來看分別為類色氨酸、類腐殖酸和類酪氨酸熒光峰.由于三維熒光光譜無法表征多糖，因此無法與圖 1中LB-EPS與TB-EPS的化學分析結果進行絕對的定量分析比較，不過仍可與蛋白質含量進行相對分析.不同有機負荷下類蛋白熒光峰強度與蛋白質濃度存在對應關系，當有機負荷較大時，EPS中蛋白質含量較低，類蛋白熒光峰的強度也相應較弱，類腐殖酸熒光峰強度與有機負荷大小并無明顯對應關系.不同污泥TB-EPS中類蛋白熒光峰與類腐植酸熒光峰強度均明顯高于LB-EPS中相應峰的強度，由于蛋白質與腐殖酸屬疏水性物質，因此更高濃度的蛋白質與腐植酸的存在使TB-EPS的疏水性強于LB-EPS.另外，TB-EPS中還存在Peak d，即類富里酸熒光峰.Peak d的強度在高有機負荷時最大，有機負荷為0時最小.由于人工配制廢水中并不存在類富里酸物質且含有極少量異養菌的污泥A中Peak d的強度極低，因此TB-EPS中的類富里酸物質為異養菌而非自養菌的代謝產物.
圖 2 不同污泥LB-EPS與TB-EPS的三維熒光光譜差異
3.3 不同有機負荷時EPS對污泥表面和絮凝性質的影響
3.3.1 EPS對污泥絮體形態的影響
圖 3是采用電子顯微鏡觀察到的不同活性污泥在分別提取LB-EPS和TB-EPS后絮體形態的變化情況，圖 4是采用掃描電子顯微鏡觀察到的不同污泥的內部結構.有研究表明自養型的硝化細菌由于生長較慢，所形成的菌落(microcolonies)是污泥絮體中最密實的一部分.由圖 3、4可知，污泥A中因存在大量硝化細菌，細菌之間排列整齊且結合緊密，其絮體結構呈規則的顆粒狀.以異養菌為主的污泥B中體型較小的球菌相互結合形成長方體菌簇，這些菌簇之間結合松散，使其絮體結構疏松.污泥C中存在絲狀菌且細菌之間結合不緊密使內部出現較多孔洞，因此污泥絮體形態不規則呈蓬松狀.李志華等通過研究發現自養顆粒污泥主要通過EPS相互聚集并密實化，而異養菌顆粒污泥主要通過絲狀菌纏繞的骨架結構實現聚集和密實化.由于自養污泥形態不同(顆粒與絮狀)，其聚集和密實化的機理也不同.由圖 3可知，當提取LB-EPS后，各污泥的絮體結構均未發生明顯變化，說明LB-EPS對不同污泥絮體結構的形成貢獻較小.當提取TB-EPS后，各污泥的絮體形態出現明顯的差異.污泥A的絮體依舊保持完整的形態結構，說明自養活性污泥之所以能夠形成密實且規則的絮體結構，并非LB-EPS或TB-EPS的作用，而是自養菌自身具有極強的生物絮凝作用.隨著TB-EPS的提取，污泥B、C中大量的細胞和菌膠團處于游離狀態，絮體中細胞連接松散，無法形成密實體.這是因為TB-EPS的疏水性更強，有利于微生物之間的聚集，并且含有大量高分子物質，可通過架橋和卷掃作用形成絮體.因此可以推斷，TB-EPS在異養活性污泥絮體聚集時發揮著主要作用.
圖 3 LB-EPS與TB-EPS對污泥絮體結構的影響(100×)
圖 4 不同污泥結構的掃描電子顯微鏡分析
3.3.2 EPS對污泥表面特性的影響
污泥絮體表面因為含有可解離的陰離子基團，所以呈負電性.污泥表面負電荷越少，疏水性越強，越有利于形成穩定的聚集體.研究表明EPS中的疏水部分主要由蛋白質組成，而多糖中含有較多親水性基團，可以增加污泥表面親水性，因此蛋白質/多糖比對污泥疏水性有決定性作用.LB-EPS包裹在污泥外層，其蛋白質/多糖比的變化可直接影響原污泥的表面性質.TB-EPS與細胞壁緊密結合，其蛋白質/多糖比的變化將影響細胞之間的聚集.3種污泥LB-EPS中蛋白質/多糖比分別為1.91、1.37、0.70，TB-EPS中蛋白質/多糖比分別為2.46、1.41、0.81.
表 1是3種污泥在分別提取LB-EPS和TB-EPS后，污泥的表面電荷和疏水性的變化.在EPS的分層提取過程中，污泥A中Zeta電位由-19.2 mV升高至-17.4 mV，RH由87.8%增大到90.5%，兩個參數的變化程度都較小，說明EPS對自養活性污泥的表面特性影響較小.雖然污泥B、C的蛋白質/多糖比在LB-EPS中比TB-EPS中略小，但是隨著LB-EPS和TB-EPS被分別提取后，污泥的Zeta電位與RH出現較為明顯的變化.當提取LB-EPS后污泥B、C的Zeta電位負電性均減少，RH均增大，說明僅存在TB-EPS時異養污泥絮體的穩定性相較于LB-EPS存在時更好;當提取TB-EPS后，污泥B、C的Zeta電位負電性出現大幅度增加，RH變小，表明沒有TB-EPS包裹的污泥，表面負電荷較大且疏水性低，此時的污泥絮體穩定性差.有LB-EPS包裹的異養污泥表面含有較多表面負電荷且疏水性低，污泥絮體不穩定可能會產生污泥解體現象;TB-EPS的存在有助于增強異養污泥穩定性.該結果與Liu等(Liu et al., 2010)的研究結相一致.污泥A的Zeta電位負電性最弱，RH最高;污泥C的Zeta電位負電性最強，RH最低;污泥B的各項指標均在A、C兩者之間.說明有機負荷為0時的自養活性污泥穩定性最好，其次為中有機負荷污泥，而高有機負荷時污泥的穩定性最差.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
表 1 LB-EPS與TB-EPS對污泥表面特性的影響
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3.3.3 EPS對污泥絮凝性能的影響
圖 5為不同污泥在分別提取LB-EPS與TB-EPS后絮凝性能的變化.由圖 5可知，有機負荷越高，出水濁度越大，FA越小.這是因為高有機負荷條件下培養的污泥Zeta電位負電性較大，RH較小.根據DLVO理論，表面負電荷增大使細胞或絮體之間的靜電斥力增大，進而導致污泥絮凝能力下降.
圖 5 LB-EPS與TB-EPS對污泥絮凝性能的影響
污泥A的出水濁度和FA在提取LB-EPS與TB-EPS后均未出現較大的變化.這也進一步驗證了3.3.1節和3.3.2節中關于LB-EPS與TB-EPS對自養污泥絮凝特性影響較小的結論.隨著LB-EPS被提取后，污泥B、C的出水濁度減少，FA增大.當提取TB-EPS后，其出水濁度明顯增大，FA迅速下降.這是由于異養污泥LB-EPS中Zeta電位負電性更強使分子間靜電斥力增大，進而阻礙了污泥的重新絮凝，并且LB-EPS結構松散，易受水力剪切作用的破壞而游離出許多微小絮體或單個細胞，導致出水濁度增大.研究發現在污泥齡較長時(16~20 d)，污泥表面的疏水性越強，越有利于細胞與絮體的粘附，菌膠團相互靠近并通過架橋作用連接，利用氫鍵進一步穩定絮體結構.綜上可知，LB-EPS和TB-EPS的組分與含量對于自養活性污泥的絮凝性能無明顯影響，而對異養活性污泥的絮凝性能有較大影響.其中被LB-EPS包裹的異養污泥含有較多表面負電荷和疏水性較差，其絮凝性能相較于僅TB-EPS包裹的污泥絮體差;由于TB-EPS中蛋白質/多糖比大，含有更多疏水性基團和高分子物質，有利于增強異養污泥絮體的絮凝能力.
4 結論
1)自養活性污泥中EPS總量及蛋白質含量高于異養活性污泥，EPS中的類富里酸物質為異養菌而非自養菌代謝產物.
2)自養活性污泥LB-EPS和TB-EPS提取后，其絮凝形態無明顯變化，自養活性污泥通過自養菌菌體自身的生物絮凝作用形成密實的污泥絮體.
3)包裹著LB-EPS的異養活性污泥表面負電性強且疏水性差，不利于生物絮凝.TB-EPS 表面負電荷少且疏水性強，其存在有助于異養活性污泥絮體聚集.
4)隨有機負荷增加，多糖含量增加，但EPS總量及蛋白質含量減少.有機負荷越高，類富里酸濃度越高，活性污泥表面Zeta電位負電性越強，RH越小，污泥絮凝穩定性越差.
