1 前言(Introduction)
生物固氮是指固氮生物利用體內(nèi)的固氮酶將N2催化還原成NH3(Howarth et al.，1988a)的過程.它是海洋和湖泊等生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力的限制性因素，影響著C和N的生物地球循環(huán).固氮作用不僅出現(xiàn)在貧營(yíng)養(yǎng)的土壤、海洋、湖泊、河口和河流等生態(tài)系統(tǒng)中;還出現(xiàn)在氮營(yíng)養(yǎng)充足甚至富營(yíng)養(yǎng)的海洋和湖泊等水環(huán)境中.
固氮速率的測(cè)定方法主要有總氮變量法、15N同位素法、乙炔還原法(Beversdorf et al., 2013;Glass et al., 2010)等.這些方法在不同的環(huán)境介質(zhì)(土壤、水環(huán)境、生物等)的固氮速率中均被不同程度的廣泛使用，并反映出不同的優(yōu)缺點(diǎn).總氮變量法是直接測(cè)定系統(tǒng)N變量的方法，其操作和計(jì)算簡(jiǎn)單，但測(cè)量誤差大、靈敏度低、準(zhǔn)確度差、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng);15N同位素法是測(cè)定固N(yùn)量較靈敏方法，靈敏度比總氮變量法高40~100倍左右，且直接采用15N標(biāo)記的氮?dú)?或溶解態(tài)氮?dú)?作為固氮過程底物，具有較高的可靠性，但其實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)、操作繁冗且須配備同位素和質(zhì)譜儀等，測(cè)定費(fèi)用高，更重要的是，由于15N2在水體中需要較長(zhǎng)時(shí)間的溶解平衡，如果測(cè)定過程時(shí)間較短，往往由于平衡不夠充分而導(dǎo)致固氮速率的低估.乙炔還原法(Acetylene Reduction Technique，簡(jiǎn)稱ART)(Hardy et al., 1968;Stewart et al., 1967)是一種較經(jīng)典的測(cè)定方法，通過測(cè)定固氮生物體中的固氮酶催化C2H2還原成C2H4(Dilworth，1966;Rusness and Burris， 1970)的量來計(jì)算固氮生物催化N2還原成NH3量的一種間接測(cè)定固氮速率方法，其計(jì)算需要乙炔還原與氮?dú)膺€原的當(dāng)量系數(shù)，并通過當(dāng)量系數(shù)轉(zhuǎn)換成固氮速率.該方法具有試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、方便、耗費(fèi)少，高準(zhǔn)確度和精度，靈敏度比15N同位素法高103~104倍(Hardy et al., 1973)，且其產(chǎn)物C2H4穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存，因而至今仍被廣泛用于各種水體、生物膜、沉積物等水環(huán)境固氮作用的研究中.
太湖富營(yíng)養(yǎng)化問題長(zhǎng)期受到關(guān)注，其根本原因是湖泊水體中N、P等營(yíng)養(yǎng)物的過量輸入.湖泊中N的外部來源主要包括河流輸入、面源輸入、大氣沉降和生物固氮等.前3種來源已有大量的的監(jiān)測(cè)和研究;但太湖水體生物固氮來源的研究和報(bào)道目前仍十分匱乏.McCarthy等(2003)在湖心區(qū)沉積物-水界面通量的研究中發(fā)現(xiàn)了水體向沉積物遷移的氮?dú)馔浚茰y(cè)該區(qū)域可能發(fā)生固氮作用，但仍缺乏直接證據(jù).已有許多湖泊的固氮研究表明，生物固氮是部分湖泊富營(yíng)養(yǎng)化過程中的重要氮源.水體的固氮作用，不僅會(huì)影響湖泊的氮收支平衡及污染物容量，還能對(duì)水體污染防治措施的有效性產(chǎn)生影響.
太湖，位于長(zhǎng)江中下游平原，是一個(gè)典型的大型淺水富營(yíng)養(yǎng)化湖泊，水域面積2338 km2，平均水深2 m，是我國(guó)第三大淺水湖泊(張路等，2004).太湖富營(yíng)養(yǎng)化機(jī)理和控制策略等迄今已有較多研究(崔廣柏等，2009;秦伯強(qiáng)等，2011)，但關(guān)于富營(yíng)養(yǎng)化問題解決方法中營(yíng)養(yǎng)鹽控制策略的有效性研究成果甚少.
本文擬通過原位模擬試驗(yàn)方法對(duì)太湖水體的固氮作用進(jìn)行研究，探索太湖水體的固氮作用的存在及其時(shí)空變化特征，為太湖氮平衡的構(gòu)建和完善、營(yíng)養(yǎng)鹽總量控制和削減提供科學(xué)依據(jù).
2 材料和方法
2.1 樣品的采集和處理
自2011年5月到2012年2月，選擇全湖33個(gè)樣點(diǎn)(圖 1)按季度(2011年5月(春季)、2011年8月(夏季)、2011年11月(秋季)、2012年2月(冬季))進(jìn)行固氮速率的測(cè)定.采樣時(shí)用GPS進(jìn)行定位，現(xiàn)場(chǎng)用便攜式多參數(shù)水質(zhì)分析儀(YSI)測(cè)定并記錄常規(guī)水質(zhì)參數(shù)、風(fēng)速風(fēng)向儀測(cè)定現(xiàn)場(chǎng)風(fēng)數(shù)據(jù).用5 L有機(jī)玻璃采水器采集0.6 m深度內(nèi)的混合水樣，根據(jù)水體中藍(lán)藻生物量的多寡對(duì)水樣進(jìn)行不同程度的預(yù)濃縮處理(25#浮游生物網(wǎng)(200目))，將原水樣和濃縮液保存于聚乙烯塑料瓶中.采樣當(dāng)日15點(diǎn)前完成采樣和水樣固氮速率的測(cè)定.
圖1 太湖樣點(diǎn)圖
2.2 研究方法
2.2.1 水體固氮作用測(cè)定
本文用ART法(Granhall and Lundgren， 1971;Stewart et al., 1967)對(duì)采集水樣進(jìn)行固氮速率的測(cè)定.固氮生物體內(nèi)的固氮酶既能將N2催化固定成NH3，也能催化C2H2還原成C2H4.C2H2和N2與固氮酶結(jié)合部位并不相同，兩者是固氮酶催化反應(yīng)的非競(jìng)爭(zhēng)性底物(Hwang et al., 1973)，因此用ART不但能準(zhǔn)確測(cè)定固氮速率，而且測(cè)定結(jié)果不受試驗(yàn)環(huán)境中N2的影響.操作過程簡(jiǎn)述如下：
取一定量濃縮(或原水)樣于培養(yǎng)瓶中，保持瓶?jī)?nèi)水體和頂空的體積比為5：1，合上膠塞，用注射器注入一定體積C2H2氣體(10%，V/V)，保持培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的C2H2分壓為10132.5 Pa(Granhall and Lundgren， 1971;Hardy et al., 1973)，在氣體注入口涂上硅橡膠防止漏氣.搖勻后將培養(yǎng)瓶懸掛放置在太湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)研究站棧橋，控制水深為30 cm左右，以保持與樣點(diǎn)基本一致的溫度、光照和風(fēng)浪擾動(dòng)等.培養(yǎng)時(shí)間為2 h(Beversdorf et al., 2013;Stewart et al., 1967)，每個(gè)樣設(shè)3個(gè)平行.培養(yǎng)結(jié)束后，向培養(yǎng)瓶中抽取一定體積頂空氣體樣品轉(zhuǎn)移預(yù)先抽過真空的玻璃瓶中室溫保存，用氣相色譜儀(GC5970II，填充柱：Porapak N;FID檢測(cè)器)對(duì)氣體樣品進(jìn)行檢測(cè)分析。
2.2.2 固氮速率計(jì)算
固氮酶催化N2和C2H2還原的方程式可以表述為：
?在提供產(chǎn)出1 mol NH3所需電子數(shù)的情況下，固氮酶會(huì)催化產(chǎn)出1.5 mol C2H4，則1.5是C2H4-NH3的理論當(dāng)量轉(zhuǎn)換系數(shù).盡管該系數(shù)在不同的生態(tài)系統(tǒng)中會(huì)存在一定差異(1.2~2.1)(Bergersen，1970;Hardy et al., 1973;Stewart et al., 1968)，但基本保持在理論值1.5附近.事實(shí)上，多數(shù)固氮作用的研究(Brooks et al., 1971;Teal et al., 1979)也都采用1.5作為兩者的轉(zhuǎn)換系數(shù).為了便于與不同生物固氮研究成果進(jìn)行比較，本研究采用1.5作為兩者的轉(zhuǎn)換系數(shù).
氣相色譜儀對(duì)氣體樣品的檢測(cè)采用保留時(shí)間進(jìn)行定性分析，峰高進(jìn)行定量分析.
固氮速率計(jì)算公式：
?式中，Anf為固氮速率(ng · L-1 · h-1);P樣品、P空白為樣品、空白樣中的C2H4的量(μL);r為水樣濃縮比例;14為N摩爾質(zhì)量(g · mol-1);1.5為固氮速率轉(zhuǎn)換系數(shù);t為培養(yǎng)時(shí)間(h);V水為試驗(yàn)水樣體積(L).
3 結(jié)果
3.1 固氮作用的空間差異
太湖水體固氮速率表現(xiàn)出明顯的空間差異(表 1，圖 2，圖 3).固氮速率的全年最高值出現(xiàn)在梅梁灣(32號(hào)點(diǎn)，Anf=16.60 ng · L-1 · h-1);最低值出現(xiàn)在貢湖灣(13號(hào)點(diǎn)，Anf=0).梅梁灣和竺山灣是固氮速率較高的湖區(qū)，貢湖灣、湖心區(qū)和西岸湖區(qū)的固氮速率總體較低.
表1 太湖各樣點(diǎn)水體固氮速率年均值
?
圖2 太湖不同湖區(qū)固氮速率
圖3 太湖水體固氮速率
在春季，太湖西岸湖區(qū)(0.17 ng · L-1 · h-1)的固氮速率較高，而東岸湖區(qū)(0.08 ng · L-1 · h-1)的固氮速率較低.夏季太湖水體的最高固氮速率出現(xiàn)在北部湖區(qū)梅梁灣(14.64 ng · L-1 · h-1);竺山灣(2.86 ng · L-1 · h-1)、湖東岸(2.21 ng · L-1 · h-1)等湖區(qū)也表現(xiàn)較強(qiáng)的固氮作用，而其他水域如湖心區(qū)、貢湖灣等的固氮作用較弱.在秋季，位于北半湖區(qū)的竺山灣(0.55 ng · L-1 · h-1)和梅梁灣(0.13 ng · L-1 · h-1)水域的固氮速率較高，其他如湖心區(qū)、東西岸區(qū)等湖區(qū)的固氮速率較低.冬季太湖水體最大固氮速率湖區(qū)為西岸區(qū)(Anf=1.03×10-4 ng · L-1 · h-1)，其他湖區(qū)的固氮速率低于檢測(cè)限或者不存在固氮作用.
3.2 固氮作用的季節(jié)變化
太湖水體的固氮速率表現(xiàn)出明顯的季節(jié)差異(圖 3、圖 4).固氮速率從春季開始逐漸增強(qiáng)，在夏季達(dá)到最高峰后經(jīng)秋季緩緩減弱，在冬季降到最低值.春季時(shí)，固氮作用較弱，Anf在0~0.41 ng · L-1 · h-1之間，均值為0.10 ng · L-1 · h-1(SD=0.092 ng · L-1 · h-1);夏季時(shí)，固氮速率顯著增加并達(dá)到全年的最高值，Anf在0~66.10 ng · L-1 · h-1之間，均值為5.88 ng · L-1 · h-1(SD=12.11 ng · L-1 · h-1)，夏季的固氮速率比春、秋季高1個(gè)數(shù)量級(jí)，比冬季高5個(gè)數(shù)量值.固氮速率在秋季逐漸降低，Anf在0~1.88 ng · L-1 · h-1之間，均值為0.14 ng · L-1 · h-1(SD=0.32 ng · L-1 · h-1)，稍高于春季.太湖水體在冬季基本不存在固氮作用，多數(shù)水體固氮速率極低，Anf在0~2.26×10-4 ng · L-1 · h-1之間，均值為5.62×10-5 ng · L-1 · h-1(SD=5.68×10-5 ng · L-1 · h-1).
?圖4 不同季節(jié)下太湖水體的固氮速率
4 討論
4.1 太湖固氮速率時(shí)空差異原因
水生態(tài)系統(tǒng)中固氮生物的生物量、營(yíng)養(yǎng)、鹽度、光照、溫度、深度、微量元素等(Fu and Bell， 2003;Howarth et al., 1988a;Wetzel，1983)都是影響固氮作用的因素.先后有Drewes、Fogg等(Fogg，1942)發(fā)現(xiàn)魚腥藻(Ananbaena spp)和束絲藻(Aphanizomenon spp)等藍(lán)藻是淡水系統(tǒng)中的主要固氮生物(Capone and Carpenter， 1982;Gruber and Sarmiento， 1997).將太湖6個(gè)湖區(qū)4個(gè)季節(jié)的固氮速率與對(duì)應(yīng)浮游生物的生物量進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，湖區(qū)固氮速率與藍(lán)藻生物量存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.452，p<0.05)(Horne and Goldman， 1972).另一方面，由于同一次采樣時(shí)間內(nèi)，太湖湖區(qū)水體的溫度基本相同(全湖最大溫差僅2.69 ℃)，溫度不會(huì)顯著影響不同湖區(qū)的固氮速率.因此，我們可以推測(cè)固氮生物藍(lán)藻的生物量是導(dǎo)致太湖水體固氮速率空間差異的主要原因.此外，不同湖區(qū)間營(yíng)養(yǎng)鹽(Smith，1992)、風(fēng)浪擾動(dòng)等因素的差異也可能會(huì)在一定程度上強(qiáng)化固氮速率的空間差異.
從湖區(qū)固氮速率和水溫的散點(diǎn)圖(圖 5)可以發(fā)現(xiàn)：固氮速率隨水溫的增加呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，相關(guān)分析得出太湖水體固氮速率與其水溫(4~32 ℃)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.01).溫度主要通過改變固氮微生物的新陳代謝和固氮酶的活性來影響固氮作用的強(qiáng)度(Wetzel，1983).一方面，溫度的適度增加能加快固氮生物的生長(zhǎng)(Canale and Vogel， 1974)，從而加強(qiáng)固氮作用(McQueen and Lean， 1987);另一方面，固氮酶活性會(huì)隨著溫度的升高而增加(Robarts and Zohary， 1987)，固氮作用隨之也會(huì)增強(qiáng).由于水體固氮速率和藍(lán)藻生物量之間的顯著相關(guān)關(guān)系和藍(lán)藻生物量的顯著季節(jié)性變化(夏高冬低)，盡管在我們的現(xiàn)場(chǎng)研究中得到的水體溫度與固氮速率之間的顯著相關(guān)性，也不能簡(jiǎn)單解釋成溫度對(duì)固氮速率的決定性作用，但其仍是導(dǎo)致太湖固氮速率夏高冬低季節(jié)性特征的一個(gè)重要原因.
?圖5 不同湖區(qū)固氮速率與水溫散點(diǎn)圖
4.2 太湖水體固氮作用的貢獻(xiàn)
不論是不同湖區(qū)，還是不同季節(jié)，太湖水體都表現(xiàn)出一定強(qiáng)度的固氮作用(表 1，圖 3)，年均Anf=1.53 ng · L-1 · h-1.以太湖水體表層0.6 m的透光層作為太湖固氮作用發(fā)生層，14 h · d-1為日固氮作用時(shí)間(Stewart et al., 1971)，則可計(jì)算出太湖水體的年固氮量為10.73 t(即4.6 mg · m-2 · a-1).與太湖其他氮源(面源、河流輸入等)相比，太湖水體的固氮量甚少，對(duì)太湖水體氮負(fù)荷的輸入貢獻(xiàn)也甚低.
不同水生態(tài)系統(tǒng)中的水體生物固氮作用存在明顯差異(表 2).太湖水體固氮速率(4.6 mg · m-2 · a-1)比部分海洋(如Pacific Ocean：2.0 mg · m-2 · a-1)高 1倍，比貧營(yíng)養(yǎng)湖泊(如Lake Superior：0.3 mg · m-2 · a-1)高1個(gè)數(shù)量級(jí);但遠(yuǎn)低于富營(yíng)養(yǎng)化湖泊(0.2~9.2 g · m-2 · a-1)(如Rietvlei dam：9.2 g · m-2 · a-1).
表2 太湖水體與其他水系統(tǒng)的固氮作用比較
?由于固氮藻在無光條件下也能利用呼吸作用提供的能量來進(jìn)行固氮作用(Horne，1979; Mullineaux et al., 1980)，而本研究選擇0.6 m透光層作為固氮作用發(fā)生層，14 h的固氮作用時(shí)間，在一定程度可能造成太湖水體固氮速率的低估.具體參見 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4.3 水體固氮作用研究的意義
為了解決淡水湖泊的氮磷過剩導(dǎo)致的富營(yíng)養(yǎng)化問題，長(zhǎng)期以來一直有單獨(dú)控氮法(Howarth and Marino， 2006)、控磷法(Vollenweider，1976;Schindler，1977)和氮磷雙控法.從氮磷比考慮，單獨(dú)控氮(Howarth and Marino， 2006)，造成的氮限制，將可能出現(xiàn)適合固氮藍(lán)藻的生長(zhǎng)從而出現(xiàn)以固氮藍(lán)藻水華替代非固氮藍(lán)藻水華的現(xiàn)象，因此，單獨(dú)控氮可能并非富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻爆發(fā)的解決方法.許多湖泊營(yíng)養(yǎng)鹽控制的實(shí)踐證明：許多湖泊采用單獨(dú)控磷來解決富營(yíng)養(yǎng)化問題的方案都并不成功.因此，固氮速率的估算，不僅可以進(jìn)一步加深太湖氮的輸入輸出過程，也可為富營(yíng)養(yǎng)化湖泊治理及營(yíng)養(yǎng)鹽的控制策略提供參考.
5 結(jié)論
1)太湖水體的固氮速率存在明顯的空間特征.梅梁灣、竺山灣等北部湖區(qū)的固氮速率明顯高于湖心區(qū)、貢湖灣等其他湖區(qū).不同湖區(qū)水體中固氮微生物的生物量(p<0.05)是導(dǎo)致太湖不同湖區(qū)固氮速率差異的主要原因.
2)太湖水體固氮速率具有明顯的季節(jié)變化特征.固氮速率表現(xiàn)出夏季最高、春秋季次之、冬季最低的特點(diǎn).溫度通過改變固氮微生物的新陳代謝和固氮酶的活性來影響水體固氮作用的強(qiáng)弱，水溫是導(dǎo)致太湖水體固氮速率季節(jié)差異的主要原因(p<0.01).
3)太湖水體存在一定的固氮作用，固氮速率為1.53 ng · L-1 · h-1，遠(yuǎn)高于部分海洋和貧營(yíng)養(yǎng)湖泊，但遠(yuǎn)低于部分中、富營(yíng)養(yǎng)湖泊.太湖年固氮量為10.73 t(4.6 mg · m-2 · a-1).
