1 引言

　　好氧顆粒污泥相比傳統(tǒng)的絮體污泥，具有規(guī)則而緊密的微生物結構、高污泥濃度、杰出的沉降性能和耐沖擊負荷等許多優(yōu)越的性能，因此，近年來備受關注.影響顆粒污泥形成的因素很多，其中，研究者們較一致地認為顆粒污泥的形成與胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)的產(chǎn)生有關.胞外聚合物是微生物在一定環(huán)境條件下分泌于胞外的復雜非均相高分子聚合物，是菌膠團、顆粒污泥和生物膜的重要組分，是維持污泥三維空間的重要骨架.目前，人們對好氧顆粒污泥中EPS的成分、提取方法、性能、影響因素等方面均進行了相關的研究，但好氧顆粒污泥形成過程中EPS的變化和作用機制仍然有待進一步明晰.因此，本研究通過建立一個SBR污水處理系統(tǒng)，分別進行普通活性污泥和好氧顆粒污泥培育，探索污泥顆粒化過程中EPS的動態(tài)變化、組分及在污泥中的空間分布.

　　2 試驗方法與材料

　　2.1 原水配制與接種污泥

　　反應器試驗用水采用人工配制污水，主要成分有CH3COONa、NH4Cl、KH2PO4、FeSO4、MgSO4、CaCl2和微量元素.進水COD為600~800 mg · L-1，氨氮為50~60 mg · L-1，總磷為9 mg · L-1左右.試驗接種的污泥來源于浙江省杭州市一座城鎮(zhèn)污水處理廠二沉池.

　　2.2 試驗裝置及運行方式

　　反應器高100 cm，直徑10 cm，有效容積為4 L，由頂部進水，每周期出水2 L，系統(tǒng)采用時間控制器進行控制，周期均為4 h.本試驗根據(jù)不同運行工況可分為3個階段：第1階段(0~28 d)，進水10 min，曝氣3 h，沉淀40 min，出水和閑置10 min;第2階段(28~46 d)，沉淀時間由40 min縮短為10 min;第3階段(46~72 d)，沉淀時間由10 min縮短為3 min.培養(yǎng)溫度為室溫.分別在第24、33和72 d對反應器中混合液進行EPS提取和檢測.

　　2.3 EPS的分析方法

　　本研究將總EPS按照組分與細菌分離難易程度及其空間分布分為3類：溶解性EPS、松散結合型EPS和緊密結合型EPS.其中，溶解性EPS是指與細胞薄弱連接或溶解在污泥所處系統(tǒng)中由細胞分泌或自溶產(chǎn)生的高分子聚合物;松散結合型EPS是指位于結合型EPS外沿，沒有明顯邊界、松散分散分布的黏性層;緊密結合型EPS是指位于結合型EPS內(nèi)部，與細胞表面緊密穩(wěn)定結合的具有特定形狀的黏性層.同時采用EPS中的兩大組分蛋白質(zhì)和多糖之和來表征總EPS.

　　污泥預處理和EPS提取采用加熱離心法.取泥，泥量為烘干后120~200 mg(如4000 mg · L-1可取40 mL);將樣品在4000 r · min-1下離心15 min，取上清液檢測溶解性EPS(Soluble EPS，S-EPS);之后再將樣品在4 ℃、10000 r · min-1(Sigma 3218K型高速離心機)下離心15 min，取上清液檢測松散結合型EPS(Loosely-bound EPS，LB-EPS);重新懸浮在去離子水中，重復上述離心操作，然后將其置于玻璃勻漿器內(nèi)4 ℃下勻漿5 min，使樣品均一化(勻漿的目的是讓聚合物充分暴露，若為顆粒污泥需要搗碎才能盡可能多的提取EPS)，加入蒸餾水稀釋到40 mL，攪勻，放入80 ℃水浴鍋加熱60 min，將樣品在4 ℃、12000 r · min-1下離心30 min，得上清液檢測緊密結合型EPS(Tightly-bound EPS，TB-EPS);過0.22 μm的濾膜，取樣5 mL左右，同時取100 mL混合液測定VSS，最終采用單位質(zhì)量污泥所產(chǎn)生的EPS來表征反應器系統(tǒng)中的EPS濃度.

　　蛋白質(zhì)的測定采用改良型BCA蛋白質(zhì)測定測試盒(上海生工：Modified BCA Assay Kit，多糖的測定采用蒽酮硫酸法.

　　EPS分布的分析采用激光共聚焦掃描電子顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscopy，CLSM).將從反應器中取出的樣品放置于液體的冷凍介質(zhì)(Frozen Section Medium Neg-50，Richard Allan Scientific)中大約15~20 min，等待冷凍介質(zhì)完全滲入樣品后，將其置于冷凍切片上快速冷凍.樣品污泥可以從赤道橫截面方向被切成不同厚度的薄片，也可完整地使用.本試驗使用被熒光染料Alxea-488(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)標記的稀釋比例為1 ∶ 10的金橙黃色孢盤菌凝集素熒光染色劑AAL-488(Vector，Bulingame，California，USA)對樣品污泥中EPS成分進行染色，該染色劑熒光的發(fā)射波長為488 nm.對于樣品污泥中的細菌成分，本試驗選用稀釋比例為1∶ 1000的核酸染料Syto 60(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA).被該染料染色后的細菌會發(fā)射出波長為633 nm的熒光.將染色后的樣品放置于一臺正置式型號為TCS SP的共聚焦掃描電子顯微鏡下進行觀察.EPS和細菌被染色后的熒光經(jīng)過激發(fā)后分別在505~545 nm和大于650 nm的波長范圍內(nèi)被捕捉和記錄.觀察使用的水鏡光圈為20×0.8 NA，掃描方向為XYZ方式，掃描圖像儲存為512×512像素圖片.

　　2.4 其它參數(shù)的分析方法

　　COD、氨氮、MLVSS、MLSS、SVI依照國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》(第4版)進行測定;污泥外觀形態(tài)變化采用Motic公司的DMWB1-223PL型光學顯微鏡進行觀察，顆粒污泥強度的測定采用的測定方法.

　　3 結果

?　　3.1 污泥外觀形態(tài)變化

　　利用光學顯微鏡對接種污泥和反應器內(nèi)的污泥外觀形態(tài)進行觀測和拍照.取運行24、33和72 d的污泥分別代表普通活性污泥期(簡稱“普通污泥”)、顆粒污泥形成初期(簡稱“顆粒初期”)和顆粒污泥形成穩(wěn)定期(簡稱“顆粒穩(wěn)定”)3個階段.其中，普通污泥期是指污泥以絮體形式存在，絮體的大小和形態(tài)由接種期開始的明顯變化直至相對穩(wěn)定，且不具有顆粒化趨勢的時期;顆粒污泥初期是指小顆粒初步形成且有不斷增大的趨勢，但其周圍仍舊存在較多絮體的時期;顆粒污泥穩(wěn)定期是指相較顆粒污泥形成初期，污泥顆粒明顯增大、規(guī)則致密，且顆粒的大小和形態(tài)相對穩(wěn)定的時期.接種污泥和3個運行工況下典型污泥的外觀形態(tài)變化如圖 1所示.可以看出，接種的城鎮(zhèn)污水處理廠污泥主要是以細小絮體為主的普通活性污泥;SBR中運行24 d的污泥出現(xiàn)了一些大的并質(zhì)輕的菌膠團，但大部分為絮體污泥;運行28 d后，減少了沉淀時間，輕質(zhì)絮體污泥容易被洗出，顆粒污泥逐漸形成，第33 d的污泥已基本顆粒化，平均顆粒粒徑為200 μm;46 d后繼續(xù)減少沉淀時間，顆粒形成更趨于穩(wěn)定，第72 d的顆粒污泥相對致密，平均粒徑達到335 μm，顆粒污泥的機械強度(以完整性系數(shù)計)為98.98%，與之前相關研究中的數(shù)據(jù)相近.

　　圖 1 SBR運行過程中污泥的外觀形態(tài)變化 (a.接種污泥;b.普通污泥,第24天;c.顆粒初期,第33天;d.顆粒穩(wěn)定,第72天)

　　3.2 污泥濃度和沉降性能變化

　　反應器中混合液污泥濃度(MLSS)和污泥容積指數(shù)(SVI)的變化如圖 2所示.隨著反應器的運行，MLSS逐漸增加.在前期普通活性污泥法運行階段，MLSS緩慢增加至6.4 g · L-1左右.沉淀時間減少至10 min時，MLSS呈現(xiàn)快速上升趨勢;沉淀時間繼續(xù)降低至3 min，篩選出沉降速度慢、沉降性能差等不利于出水水質(zhì)的絮體污泥，此時MLSS有所降低，而后又緩慢上升直至最后基本穩(wěn)定在10 g · L-1左右.原接種污泥沉降性能差，SVI為123.2 mL · g-1，之后SVI的曲線一直呈現(xiàn)下降趨勢，直至第28 d，即沉降時間為10 min后，SVI迅速下降并漸漸穩(wěn)定在50 mL · g-1附近，進一步將沉降時間縮短后，SVI隨運行時間的延長而繼續(xù)降低至40 mL · g-1附近.隨著好氧污泥顆粒化的進程，MLSS逐漸升高，SVI逐漸降低，說明了污泥濃度和沉降性能的提高.

　　圖 2 好氧污泥顆粒化培養(yǎng)中MLSS和SVI的變化

　　3.3 顆粒化前后污染物去除對比

　　顆粒化前后SBR典型周期中氨氮和COD的變化如圖 3所示.由圖 3可知，顆粒化前后氨氮去除率均接近100%.隨著氨氮快速降低直至為零，亞硝氮先增加后減少，硝氮逐漸增加，總氮基本呈現(xiàn)先快速下降后緩慢上升的趨勢.顆粒化前后COD均呈現(xiàn)先快速下降后略有上升再逐漸下降的趨勢，普通活性污泥的COD去除率為94.05%，好氧顆粒污泥的COD去除率為97.07%.可以看出，普通活性污泥和顆粒污泥在氨氮和有機物的去除方面幾乎沒有區(qū)別.

　　圖 3 普通污泥和顆粒污泥典型周期中氨氮、亞硝氮、硝氮、總氮和COD的變化

　　3.4 不同類型EPS的變化

　　顆粒化過程中總EPS、溶解性EPS、松散結合型EPS和緊密結合型EPS含量的變化如圖 4所示.曝氣末普通污泥、顆粒初期和顆粒穩(wěn)定期污泥中總EPS含量分別為162.96、226.83和231.15 mg · g-1(以VSS計，下同)，這說明顆粒污泥總EPS均比普通污泥高.目前存在的胞外聚合物假說認為，胞外聚合物EPS能通過架橋等作用連接和粘附細胞，從而形成顆粒污泥.結合試驗結果表明，EPS在污泥的絮凝性和顆粒結構的穩(wěn)定性方面都具有重要意義.溶解性EPS在普通污泥中數(shù)量極少，在顆粒初期污泥中為67.90 mg · g-1，占總EPS的31.48%，顆粒穩(wěn)定污泥中為35.32 mg · g-1，占總EPS的22.60%，這表明顆粒污泥中溶解性EPS都高于普通污泥，且顆粒形成初期增長明顯.觀察圖 4可以得出顆粒化過程中存在松散結合型EPS，但相比總EPS，松散結合型EPS含量較低且變化幅度不大.曝氣初期，顆粒污泥中松散結合型EPS均高于普通污泥，隨著曝氣時間的延長，有下降的趨勢，在此過程中，松散結合型EPS是否被細菌利用、降解或轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)還有待更進一步的研究.此外，曝氣末普通污泥中緊密結合型EPS為161.06 mg · g-1，占總EPS的98.83%.顆粒初期污泥中含有155.42 mg · g-1，占總EPS的68.52%，顆粒穩(wěn)定期污泥中為178.92 mg · g-1，占總EPS的77.40%.不難看出，3類污泥中EPS含量均以緊密結合型EPS為主要成分.對比曝氣起點和終點緊密結合型EPS變化的幅度發(fā)現(xiàn)，普通污泥差值為50.27 mg · g-1，顆粒初期差值縮小為15.84 mg · g-1，顆粒穩(wěn)定期進一步縮小為6.12 mg · g-1，這說明緊密結合型EPS含量在顆粒污泥系統(tǒng)中相對穩(wěn)定，而普通污泥系統(tǒng)中的EPS受沉淀和厭氧期的影響較大，這可能是普通污泥沒有顆粒污泥更為密實結構的原因.

　　圖 4 顆粒化過程中總EPS、溶解性EPS、松散結合型EPS和緊密結合型EPS含量的變化

　　3.5 EPS中蛋白質(zhì)和多糖的變化

　　顆粒化過程中蛋白質(zhì)和多糖含量的變化如圖 5所示.普通污泥和顆粒污泥中蛋白質(zhì)含量均高于多糖，是污泥EPS中的主要成分.對比曝氣周期終點，普通污泥中蛋白質(zhì)為152.24 mg · g-1(以VSS計，下同)，占總EPS的93.42%，顆粒初期污泥中蛋白質(zhì)為214.37 mg · g-1，占總EPS的94.51%，顆粒穩(wěn)定期污泥中蛋白質(zhì)為215.76 mg · g-1，占總EPS的93.34%.這說明顆粒形成初期蛋白質(zhì)含量有明顯上升，而顆粒初期和顆粒穩(wěn)定期污泥中蛋白質(zhì)含量相差不多，較為穩(wěn)定.觀察一個典型周期中蛋白質(zhì)和多糖的變化趨勢可以發(fā)現(xiàn)，除了顆粒穩(wěn)定污泥30 min處蛋白質(zhì)含量的特例外，蛋白質(zhì)和多糖的變化趨勢都是先降低后上升，這個特例的具體成因還有待進一步的研究分析.蛋白質(zhì)和多糖在顆粒污泥中的含量都分別高于普通污泥中兩者的含量.同時隨著污泥的顆粒化，含量較少的多糖一直呈增長的趨勢.這 是因為胞外多糖本身為高分子粘性物質(zhì)，可以作為細胞間連接和粘附的基質(zhì)，促進微生物聚集形成并穩(wěn)定顆粒的三維立體結構.研究發(fā)現(xiàn)，顆粒污泥形成過程中多糖含量會隨著剪切力的增加而急劇增加，認為EPS中多糖對顆粒污泥形成起著重要的粘結作用.且有研究表明，蛋白質(zhì)比多糖更易與金屬離子通過靜電作用而鍵合，從而成為影響微生物聚集體形成的關鍵因素.因此，蛋白質(zhì)和多糖都能促進微生物的聚集，有利于顆粒污泥的形成.

　　圖 5 顆粒化過程中蛋白質(zhì)和多糖含量的變化

　　3.6 污泥中EPS分布的變化

　　圖 6分別為普通污泥時期絮體污泥、顆粒穩(wěn)定期顆粒污泥表面和顆粒污泥內(nèi)部縱斷面切片的CLSM圖.圖中紅色代表細菌，綠色代表EPS的分布.從圖可以看出，呈絮體和膠團狀的普通污泥，結構相對松散，體積微小，EPS和細菌的分布較為均勻，兩者交織粘接.污泥顆粒體積明顯變大，呈現(xiàn)規(guī)則球形，表面密實，顆粒表面分布著大量細菌和EPS，其中，細菌的分布面積大于EPS.污泥顆粒縱斷面顯示出細菌主要分布在顆粒的表面，在其內(nèi)部細菌數(shù)量明顯減少，主要分布的是EPS.由于顆粒污泥有著比絮體污泥更大的體量和更致密的結構，在顆粒化的過程中，細菌分泌的EPS實際上成為細菌相互粘結的類似膠水的物質(zhì)，有利于顆粒形成和增大.隨著顆粒粒徑的增加，顆粒污泥中基質(zhì)傳遞的阻力也隨之增大，細菌不斷向表面遷移從而能獲得足夠的食物和氧，這可能是造成細菌和EPS分布變化的主要原因.

　　圖 6 普通污泥和顆粒污泥中細菌(紅色)和EPS(綠色)的分布變化 (a.普通污泥絮體表面，b.污泥顆粒表面,c.污泥顆粒斷面)

　　4 結論

　　1)顆粒污泥相比普通活性污泥，反應器中的MLSS可達到10 g · L-1，SVI可達到40 mL · g-1，兩者COD和氨氮的處理效率近似.

　　2)普通污泥和顆粒污泥中蛋白質(zhì)含量均高于多糖，是污泥EPS中的主要成分.顆粒形成初期蛋白質(zhì)含量有明顯上升，一個典型周期中蛋白質(zhì)和多糖的變化趨勢普遍是先降低后上升，蛋白質(zhì)和多糖在顆粒污泥中的含量都分別高于普通污泥中兩者的含量.同時隨著顆粒化過程，含量較少的多糖一直呈增長的趨勢.

　　3)顆粒污泥中總EPS和溶解性EPS含量均高于普通污泥，且顆粒形成初期溶解性EPS增長明顯.顆粒化過程中存在松散結合型EPS，但含量較低且變化幅度不大.曝氣初期，顆粒污泥中松散結合型EPS均高于普通污泥，隨著曝氣時間的延長，有下降的趨勢.3類污泥中EPS含量均以緊密結合型EPS為主要成分，緊密結合型EPS含量在顆粒污泥中相對穩(wěn)定.

　　4)CLSM圖像顯示，好氧污泥顆粒表面分布著細菌和EPS，其中心主要分布的是EPS.