1 引言

　　養殖污水和液態排泄物是集約化畜禽養殖場污染物無害化處理的難點.目前，規模化畜禽養殖場的污水通常采用沼氣池厭氧發酵進行處理，但產生的數量巨大的沼液中仍然含有高濃度的氮磷等營養鹽.隨著農村城鎮化進程的推進，消納沼液的耕地日漸不足，產生的沼液直排到水體中，將會導致自然水體嚴重富營養化.如何凈化沼液越來越成為規模化畜禽養殖場可持續發展的制約因素.

　　微藻屬于光合自養型生物，在自然界廣泛分布，能有效吸收利用水體中的氮磷等營養物質，很早就被人們用以處理污水、凈化環境.同時，微藻也是十分重要的生物資源，微藻細胞營養豐富，含多種生理活性物質，某些微藻在特定的培養條件下能選擇性地蓄積高附加值的產品.利用微藻生產生物柴油或單細胞飼料蛋白源是當前微藻開發利用的熱點.若能利用養殖場污水培養產油微藻，既可以利用微藻凈化污水，還能為微藻生物柴油的生產提供資源，一舉兩得.

　　因此，本文選擇了15株淡水微藻，在實驗室條件下考察其在豬場養殖污水中的生長性能及其對污水中氮磷的去除效果，并檢測利用豬場養殖污水培養的各株微藻的細胞蛋白含量和脂肪酸組成，以期為豬場養殖污水的無害化高效凈化處理篩選出合適的藻株.

　　2 材料與方法

?　　2.1 試驗材料

　　2.1.1 豬場養殖污水

　　豬場養殖污水取自浙江嘉興余新鎮敦好農牧有限公司的養豬場.養殖污水經過厭氧發酵及露天氧化塘沉淀處理后，用于本試驗.試驗用污水的水質狀況如表 1所示.

　　表1 試驗用豬場養殖污水的水質狀況

　　2.1.2 試驗藻株

　　試驗用15個藻株均取自上海海洋大學生物餌料研究室微藻種庫，分別為纖維藻(Ankistrodesmus sp.)SHOU-F1、橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)SHOU-F3、單生卵囊藻(Oocystis solitaria)SHOU-F5、多棘柵藻(Scenedesmus spinosus)SHOU-F7、多棘柵藻(S. spinosus)SHOU-F8、肥壯蹄形藻(Kirchneriella obesa)SHOU-F9、斜生柵藻(S. obliquus)SHOU-F17、淡水小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F19、橢圓小球藻(Ch.ellipsoidea)SHOU-F20、斜生柵藻(S.obliquus)SHOU-F21、四球藻(Tetrachlorella alternans)SHOU-F24、鐮形纖維藻(A.falcatus)SHOU-F26、小球藻(Chlorella sp.)SHOU-F28、四尾柵藻(S. quadric and a)SHOU-F35和針形纖維藻(A. acicularis)SHOU-F120.

　　2.2 試驗方法

　　2.2.1 藻種接種及培養

　　將各藻株先于f/2培養基中擴培，待培養到一定數量后，離心收集藻細胞，將藻細胞分別接種到經高壓滅菌后的豬場養殖污水中，接種密度為2.0×106 cells · mL-1左右.將接種后的藻液在溫度25 ℃、光照1800 lx、光照周期24 h/0 h(L : D)的條件下培養，每天定時搖瓶.培養20 d后，測定藻細胞密度、培養液氮磷含量、藻細胞蛋白含量及脂肪酸組成.

　　2.2.2 微藻生長檢測

　　培養開始和結束時用血球計數板測定藻細胞密度，并根據公式K=(lnNt -lnN0)/t計算相對生長率，其中，N0為培養初始藻細胞密度(cells · mL-1)，Nt為經過t時間后培養液中的藻細胞密度(cells · mL-1)，t為培養時間(d).測定平行3次.

　　2.2.3 藻細胞干重測定

　　取30 mL藻液，用預先恒重的0. 45 μm 濾膜抽濾，然后將濾膜再次恒重，計算藻細胞的生物量.測定平行2次.

　　2.2.4 水質指標測定

　　用0.45 μm 濾膜過濾藻液，然后參照水和廢水監測分析方法(第4版)(國家環境保測定濾液中氮磷，總氮測定采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法，氨態氮測定采用納氏試劑分光光度法，硝態氮測定采用紫外分光光度法，總磷測定采用鉬酸銨分光光度法.測定設2個平行.

　　氮、磷去除率r的計算公式為：r=(C0-Ct)/C0×100%，其中，C0和Ct分別為初始氮磷的濃度和培養t天后的濃度(mg · L-1).

　　2.2.5 蛋白含量測定

　　藻細胞蛋白含量的測定參照福林-酚測蛋白法進行，每藻株平行測定3次.

　　2.2.6 脂肪酸含量測定

　　藻細胞脂肪酸含量的測定參照文獻方法進行.稱100 mg濕樣(離心后去水)至帶硅膠襯里螺旋帽的15 mL棕色螺紋口頂空瓶中，加入250 μL C19-甲苯溶液(濃度0.2 mg · mL-1)，漩渦混勻后，加2 mL甲醇鈉(NaOMe，0.5 mol · L-1)，置于超聲波清洗機中80 ℃水浴混勻20 min;冷卻至室溫后，加2 mL BF3-甲醇溶液(14%)，再置于超聲波清洗機中80 ℃水浴混勻20 min;冷卻至室溫后，加800 μL去離子水和1200 μL正己烷，漩渦混勻后，4000 r · min-1離心3min，將上層含有脂肪酸甲酯的正己烷-甲苯層轉移至小玻璃瓶中，于氣相-質譜聯用儀上參照文獻方法檢測脂肪酸含量.定量分析時采用對各組分峰面積積分，用歸一化法計算出脂肪酸組分的百分含量(以占脂肪酸總量的百分比表示).

　　各微藻脂肪酸甲酯的理論烷基值參照文獻的方法進行計算(Cetane Number，CN).

　　2.3 數據的統計分析

　　結果以平均值±標準差表示，采用PASW.Statistics.18.0軟件進行方差分析并作Duncan多重比較，p<0.05表示差異顯著.

　　3 結果

　　3.1 不同微藻藻株在豬場養殖污水中的生長性能

　　由表 2可以看出，試驗條件下，小球藻SHOU-F28相對生長率最高，為0.15;其次為多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和斜生柵藻SHOU-F21，3種柵藻的相對生長率分別為0.12、0.13和0.11;單生卵囊藻SHOU-F5、橢圓小球藻SHOU-F3、斜生柵藻SHOU-F17和針形纖維藻SHOU-F120的相對生長率最低.

　　表2 不同微藻藻株在豬場養殖污水中的生長性能

　　3.2 不同微藻藻株對豬場養殖污水中總氮的去除效果

　　豬場養殖污水經高壓滅菌消毒后，水體中氮含量略有減少，總氮為30.00 mg · L-1，氨態氮14.00 mg · L-1，硝態氮14.00 mg · L-1.不同藻株對養殖污水中總氮表現出不同的去除效果(表 3)，多棘柵藻SHOU-F7和多棘柵藻SHOU-F8的總氮去除率最高(均為93.25%)，其次為四尾柵藻SHOU-F35(92.74%)、單生卵囊藻SHOU-F5(91.73%)和斜生柵藻SHOU-F21(87.78%)，纖維藻SHOU-F1、淡水小球藻SHOU-F19、小球藻SHOU-F28和針形纖維藻SHOU-F120對豬場養殖污水總氮的去除率較低，去除率僅為50.00%左右.

　　表3 不同微藻藻株對豬場養殖污水中總氮的去除效果

　　3.3 不同微藻藻株對豬場養殖污水中氨態氮的去除效果

　　從氨態氮的去除率來看(表 4)，橢圓小球藻SHOU-F3、單生卵囊藻SHOU-F5、多棘柵藻SHOU-F8、肥壯蹄形藻SHOU-F9、斜生柵藻SHOU-F17、橢圓小球藻SHOU-F20、斜生柵藻SHOU-F21、四球藻SHOU-F24、鐮形纖維藻SHOU-F26、小球藻SHOU-F28和四尾柵藻SHOU-F35對氨態氮的去除率均在95.00%以上，去除率最低的是淡水小球藻SHOU-F19，去除率為78.43%.

　　表4 不同微藻藻株對豬場養殖污水中氨態氮的去除效果

　　3.4 不同微藻藻株對豬場養殖污水中硝態氮的去除效果

　　由表 5可知，多棘柵藻SHOU-F7和多棘柵藻SHOU-F8對污水中硝態氮的去除率最高，均達100%;其次為四尾柵藻SHOU-F35(99.61%)、單生卵囊藻SHOU-F5(99.21%)和斜生柵藻SHOU-F21(97.14%);針形纖維藻SHOU-F120對硝態氮的去除率最低，僅為39.75%.

　　表5 不同微藻藻株對豬場養殖污水中硝態氮的去除效果

　　3.5 不同微藻藻株對豬場養殖污水中總磷的去除效果

　　由表 6可知，試驗用各株微藻對豬場養殖污水中總磷的去除率很高，基本在90.00%以上，尤以斜生柵藻SHOU-F21、淡水小球藻SHOU-F19、多棘柵藻SHOU-F7、四尾柵藻SHOU-F35和多棘柵藻SHOU-F8對總磷的去除率高，可達到97.00%以上.

　　表6 不同微藻藻株對豬場養殖污水中總磷的去除效果

　　3.6 利用豬場養殖污水培養的微藻細胞蛋白含量

　　利用豬場養殖污水培養的各株試驗微藻的藻細胞蛋白含量介于23.87%~43.90%之間(表 7).橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的蛋白含量分別為43.90%、38.28%和37.35%，顯著高于其他微藻.多棘柵藻SHOU-F7和多棘柵藻SHOU-F8的細胞蛋白含量最低.

　　表7 豬場養殖污水培養的微藻藻細胞蛋白含量

　　3.7 利用豬場養殖污水培養的微藻藻細胞脂肪酸組成

　　由表 8可以看出，15株微藻細胞脂肪酸組成各不相同，但16 : 0和18 : 3n3含量在所有藻株中均較高.3種纖維藻(纖維藻SHOU-F1、鐮形纖維藻SHOU-F26和針形纖維藻SHOU-F120)的脂肪酸組成相近，16 : 0、16 : 4n3、18 : 1n9、18 : 2n6和18 : 3n3是纖維藻的主要脂肪酸.4種小球藻中，橢圓小球藻SHOU-F3和橢圓小球藻SHOU-F20的脂肪酸組成較接近，含有極豐富的18 : 2n6，且18 : 3n3和16 : 2n6含量較高;淡水小球藻SHOU-F19含豐富的18 : 3n3和18 : 1n9，18 : 2n6的含量很低;小球藻SHOU-F28含豐富的18 : 3n3和18 : 2n6，但18 : 1n9和16 : 2n6的含量很低.5種柵藻中，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、斜生柵藻SHOU-F21和四尾柵藻SHOU-F35均含有較為豐富的18 : 2n6和18 : 3n3，而斜生柵藻SHOU-F17含有極豐富的18 : 3n3，但18 : 2n6含量較低.單生卵囊藻SHOU-F5和肥壯蹄形藻SHOU-F9的脂肪酸組成中，18 : 3n3含量很高，但18 : 2n6含量較低.根據脂肪酸組成計算得到的脂肪酸甲酯的理論烷基值，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和針形纖維藻SHOU-F120的理論烷基值較高，分別為48.70、47.21、47.66和47.06.

　　表8 豬場養殖污水培養的微藻藻細胞脂肪酸組成

　　4 討論

　　微藻是光能自養型生物，以水為電子供體，以CO2為碳源，通過光合作用將光能轉化為化學能貯存在藻細胞內供細胞代謝.在代謝過程中，微藻細胞需要將環境中的N、P等元素吸收到藻細胞內，以合成藻細胞內各組成成分，在此過程中細胞外環境中的氮磷水平逐步降低.此外，微藻細胞對水環境中的N、P及重金屬等物質也具有不同程度的吸附及富集作用，從而使污水得到凈化.從15株微藻在豬場養殖污水中的生長性能可以看出，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和斜生柵藻SHOU-F21的相對生長率高，細胞增長快，說明上述柵藻具有較高的耐污能力，這與很多學者報道的關于選用柵藻來處理生活污水或者工業污水是一致的.

　　從各株微藻對養殖污水中總氮的去除率看，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、四尾柵藻 SHOU-F35、斜生柵藻SHOU-F21和單生卵囊藻SHOU-F5對豬場養殖污水的總氮去除率都很高，經多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和四尾柵藻SHOU-F35處理后，養殖污水的總氮水平接近2 mg · L-1，基本達到了地表水環境質量標準(GB 3838-2002)的Ⅴ類水總氮要求.從各株微藻對養殖污水中氨態氮的去除率看，除纖維藻SHOU-F1、淡水小球藻SHOU-F19及針形纖維藻SHOU-F120外，其余試驗微藻均能將養殖污水中的氨態氮從14 mg · L-1降低到2 mg · L-1以下，達到地表水環境質量標準(GB 3838-2002)的Ⅴ類水氨態氮要求，其中，橢圓小球藻SHOU-F3、單生卵囊藻SHOU-F5、多棘柵藻SHOU-F8、肥壯蹄形藻SHOU-F9、斜生柵藻SHOU-F17、橢圓小球藻SHOU-F20、四球藻SHOU-F24、鐮形纖維藻SHOU-F26、小球藻SHOU-F28和四尾柵藻SHOU-F35更是將污水的氨態氮降到0.5 mg · L-1以下，達到了地表水環境質量標準Ⅱ類水標準.報道小球藻對模擬的養殖廢水的氮磷有很好的去除效果，對水體中氨態氮的去除率達到80%以上，對磷的去除率達到85%以上.利用蛋白核小球藻和柵藻對沉淀的污水和活性污水進行處理，結果表明，兩種微藻對沉淀的污水的總磷和無機氮的去除率達到80%，并且蛋白核小球藻比柵藻處理效果更好.利用蛋白核小球藻對乙醇發酵的廢水進行處理可以實現廢水的循環利用.從各株微藻對養殖污水中硝態氮的去除效果看，單生卵囊藻SHOU-F5、多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、斜生柵藻SHOU-F17、斜生柵藻SHOU-F21和四尾柵藻SHOU-F35也均能將養殖污水中的硝態氮從14 mg · L-1降低到2 mg · L-1以下.15株微藻對豬場養殖污水中總磷的去除率都很高，均在90%以上，經微藻處理后的養殖污水中總磷的水平均降低到0.2 mg · L-1以下，達到了地表水的Ⅱ~Ⅲ類標準.因此，綜合本試驗各株微藻對養殖污水中總氮、氨態氮、硝態氮和總磷的凈化效果，多棘柵藻SHOU-F8和四尾柵藻SHOU-F35能夠將豬場養殖污水凈化并達到排放標準.

　　不同藻種及同種藻不同株系對污水中不同形態氮的凈化效果可能與藻種(株)的內在生理特性差異有關.已有報道表明，小球藻對污水中氨態氮的去除效果較好.研究認為，小球藻能夠較好地去除水產加工廢水中的氨態氮.報道，小球藻在無光異養條件下能利用啤酒廠污水中多種營養成分，且能去除污水中的氨態氮并將它們轉化為細胞中的蛋白質、葉綠素等含氮物質，同時顯著地降低污水中的COD和BOD.的研究表明，斜生柵藻去除硝態氮效果最好.利用柵藻LX1對由不同氮源配制的培養液進行處理，結果表明，柵藻LX1對以硝酸鹽和尿素作為氮源的培養液的氮磷去除效果較氯化銨作為氮源的好，能去除90%的總氮和將近100%的總磷;而氯化銨作為氮源，氮磷的去除率僅為31.1%和76.4%.微藻對水環境中氮磷的凈化效果也與藻細胞濃度、pH、溫度、光照強度和培養周期等影響藻類生長的因素有關.培養液中氮磷組合濃度不同會影響小球藻對氮磷的吸收，升高溫度或加強光照有利于小球藻對磷、氮的吸收，在最佳pH條件下，小球藻對氮磷的吸收率可達80%左右.

　　由于魚粉資源的短缺，新型飼料蛋白源的開發是水產動物營養與飼料研究的熱點之一.單細胞微藻蛋白是重要的潛在蛋白源，螺旋藻和小球藻已作為單細胞蛋白源和飼料添加劑加以應用.本研究表明，15株微藻細胞蛋白含量均在20%以上，達到蛋白質飼料的標準.其中，橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的蛋白含量分別達43.90%、38.28%和37.35%，可與常用植物蛋白源豆粕(蛋白含量42%~48%)及菜籽粕(35%~38%)相媲美.而且，橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的細胞中含有豐富的亞油酸(18 : 2n6)和亞麻酸(18 : 3n3)(表 8).亞油酸和亞麻酸是陸生動物及淡水魚類的必需脂肪酸.因此，利用豬場養殖污水開展橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28的培養以獲得飼料蛋白源或飼料添加劑具有潛在的開發價值.

　　本研究中，單生卵囊藻SHOU-F5、肥壯蹄形藻SHOU-F9和四球藻SHOU-F24的蛋白含量分別為35.03%、31.24%和30.73%.而在適宜的光照和溫度條件下用f/2培養基培養的單生卵囊藻SHOU-F5、肥壯蹄形藻SHOU-F9和四球藻SHOU-F24的蛋白含量分別為27.61%、25.09%和23.08%.本研究各微藻的蛋白含量均較高，這可能與微藻培養液中氮的水平差異有關.已有的研究表明，培養液中高的氮磷濃度有利于微藻合成蛋白質.養殖污水中的氮磷含量顯著高于f/2培養基中的氮磷水平.

　　21世紀，人類面對能源和水資源雙重危機和挑戰，基于微藻培養的污水深度處理和生物柴油生產耦合系統具有廣闊的發展前景.微藻生產生物能源中，利用污水培養產油微藻，既可以利用微藻使污水再生利用，還可以為能源微藻生產生物柴油提供資源，一舉兩得.概述了微藻深度脫氮除磷技術、微藻生產生物能源的研究現狀，并提出了將污水處理工藝和生產工藝耦合的概念，實現污水處理系統從“處理工藝”向“生產工藝”的轉化利用二級污水對分離出的淡水柵藻進行搖瓶培養，并和11種高油脂含量的微藻進行比較，結果顯示，柵藻對污水有很強的耐受力，生物量能達到0.11 g · L-1，總脂含量為31%~33%，在10 d培養中，油脂產率最高為0.008 g · L-1 · d-1，并且能有效地去除無機營養物質，總氮總磷去除率達到98%，說明柵藻是耦合污水處理和生產生物柴油的優良藻種.

　　烷基值是影響生物柴油點火性能的關鍵因素，也影響生物柴油燃燒后的污染物排放水平，高烷基值的生物柴油往往具有較低的氮氧化物排.而微藻生物柴油的烷基值則由微藻脂肪酸組成決定.根據美國生物柴油標準，生物柴油烷基值最低不得低于47，而從本研究中各株微藻脂肪酸甲酯的理論烷基值看，多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和針形纖維藻SHOU-F120的理論烷基值(CN)較高，分別為48.70、47.21、47.66和47.06.因此，利用豬場養殖污水養殖多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8、淡水小球藻SHOU-F19和針形纖維藻SHOU-F120用于微藻生物柴油的生產具有較好的可行性.從污水凈化耦合微藻生物柴油生產角度考慮，多棘柵藻SHOU-F8是合適的藻株.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。

　　5 結論

　　1)多棘柵藻SHOU-F7、多棘柵藻SHOU-F8和四尾柵藻SHOU-F35是豬場養殖污水氮磷凈化的適宜藻株，能夠將養殖污水的氮磷降低到地表Ⅴ類水標準，且多棘柵藻SHOU-F8是豬場養殖污水凈化耦合微藻生物柴油生產的合適藻株.

　　2)利用豬場養殖污水培養的橢圓小球藻SHOU-F3、針形纖維藻SHOU-F120和小球藻SHOU-F28，具有高的蛋白含量(37.35%~43.90%)及豐富的亞油酸和亞麻酸，具備作為飼料蛋白源或飼料添加劑的潛在開發價值.