1 引言

　　依賴(lài)于微生物的厭氧消化作用能夠?qū)⒍喾N有機(jī)廢水和固體廢物轉(zhuǎn)化為甲烷、氫氣等清潔能源，是一種環(huán)境友好型的新能源生產(chǎn)途徑，也是目前處理工農(nóng)業(yè)有機(jī)廢物的一個(gè)重要手段.厭氧消化的核心是微生物群，因此，獲得高活性的厭氧消化菌群是有效轉(zhuǎn)化有機(jī)廢棄物為能源物質(zhì)的重要保障.生物反應(yīng)器內(nèi)的厭氧消化菌群具有復(fù)雜的組成，通常被劃分為3類(lèi)，即酸化菌群、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌群以及產(chǎn)甲烷菌群.其活性受多種因素影響，包括反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)、pH值、水力停留時(shí)間等.Nadarajah等認(rèn)為溫度是厭氧消化菌群的重要影響因子，將影響生物反應(yīng)器內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)、化學(xué)需氧量(Chemical Oxygen Demand，COD)去除率、出水懸浮固體(Effluent Suspended Solids，ESS)和污泥指數(shù)(Sludge Volume Index，SVI)等.

　　通常厭氧消化作用在2個(gè)溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，即中溫厭氧消化和高溫厭氧消化.良好高溫厭氧消化菌群在馴化之初，菌源常取自于自然環(huán)境如土壤、河道底泥、牛羊糞便以及常溫活性污泥等.在提升溫度的富集培養(yǎng)過(guò)程中，逐漸形成穩(wěn)定的厭氧消化菌群.Pettersson等的研究認(rèn)為，培養(yǎng)溫度改變會(huì)給菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)整帶來(lái)新的選擇壓力.溫度轉(zhuǎn)變幅度越大，這種選擇壓力越強(qiáng)烈，并增加菌群結(jié)構(gòu)調(diào)整的幅度.同時(shí)，溫度可能影響菌群變化的周轉(zhuǎn)速率，高的周轉(zhuǎn)速率使菌群更加快速的更換掉不適應(yīng)新溫度的菌群.Zheng等利用分子生物學(xué)的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高溫的產(chǎn)甲烷古菌可存在于常溫厭氧反應(yīng)器中，反之亦然，而其生物量取決于培養(yǎng)溫度.Ahring探索了高溫厭氧消化過(guò)程溫度變化對(duì)菌群生物量的影響，結(jié)果顯示當(dāng)將一個(gè)連續(xù)攪拌反應(yīng)器的培養(yǎng)溫度從55 ℃提高到65 ℃，細(xì)菌的生物量將有明顯的下降，而古菌的生物量會(huì)有上升，當(dāng)溫度達(dá)到65 ℃時(shí)，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌具有明顯的生物活性.

　　可見(jiàn)，溫度的轉(zhuǎn)變對(duì)厭氧消化菌群結(jié)構(gòu)和功能都有強(qiáng)烈的影響.為了減少溫度對(duì)厭氧消化菌群的沖擊，在厭氧生物反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)通常采用梯度升溫的方法(韓育宏等，2009).本研究則利用37 ℃的中溫厭氧消化菌群直接轉(zhuǎn)入50 ℃培養(yǎng)，并通過(guò)連續(xù)進(jìn)料糖蜜有機(jī)廢水馴化高溫厭氧消化菌群，進(jìn)而考察高溫馴化過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)、多樣性及功能的變化特征.研究結(jié)果對(duì)闡明厭氧發(fā)酵菌群在溫度劇烈變化帶來(lái)的選擇壓力下菌群結(jié)構(gòu)與功能的變化趨勢(shì)，對(duì)改進(jìn)高溫厭氧消化菌群富集方法具有重要意義.

　　2 材料與方法

　　2.1 厭氧反應(yīng)器運(yùn)行條件

　　400 mL實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的中溫(37 ℃)厭氧消化秸稈、豬、牛糞便的活性污泥注入1 L自制厭氧反應(yīng)器中，自來(lái)水補(bǔ)充至800 mL，放置于50 ℃條件下培養(yǎng).高濃度糖蜜有機(jī)廢水(100000 mg·L-1 COD)(李杰等，2011)作為厭氧消化原料，每2 d進(jìn)料1次，每次30 mL(水力停留時(shí)間(Hydraulic Retention Time，HRT)=27 d).每次進(jìn)料前從反應(yīng)裝置中抽出30 mL厭氧消化液，用于理化指標(biāo)與微生物多樣性分析，以及維持反應(yīng)體系體積平衡，厭氧反應(yīng)器裝置見(jiàn)圖 1.

　　圖 1厭氧消化反應(yīng)器(A：進(jìn)/取料口, B：出氣口, C：厭氧發(fā)酵瓶, D：緩沖裝置, E：集氣袋, F：連接管)

　　2.2 理化指標(biāo)分析

　　1)pH 取待測(cè)液0.5 mL，用日本HORIBA B-212型微量pH計(jì)(Compact pH meter，model B-212，Japan)測(cè)定pH值.

　　2)化學(xué)需氧量(COD)0.25 mmol·L-1 K2Cr2O7 溶液與Ag2SO4 溶液(Ag2SO4 /濃H2SO4質(zhì)量體積比=1/100)按體積比1:3混合，記為溶液A.取2 mL 待測(cè)樣品、3 mL 溶液A、少許HgSO4(屏蔽Cl-)，加入10 mL 消解管中，在消解儀上消解(150 ℃)2 h.消解的樣品冷卻后利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品OD值.空白控制使用蒸餾水替代樣品溶液.

　　3)沼氣總量及甲烷含量 每日生產(chǎn)沼氣使用集氣袋收集，利用排水集氣法測(cè)定總量.沼氣中甲烷含量用英國(guó)Geotech 公司的沼氣成分測(cè)定儀(型號(hào)為Biogas Check)測(cè)定.

　　4)總固體(Total Solids，TS)含量和揮發(fā)性固體(Volatile Solid，VS)含量 采用重量法測(cè)定.

　　5)揮發(fā)性有機(jī)酸(Volatile Fatty Acid，VFA)含量 1 mL消化液10000 r·min-1離心15 min，取0.5 mL上清，加入0.5 mL乙氰，充分混勻后，冰上保持10 min，10000 r·min-1離心15 min后過(guò)0.22 μm去除蛋白.前處理樣品檢測(cè)有機(jī)酸，使用LC/MS-2010A高效液相色譜(Shimadzu，Kyoto，Japan).檢測(cè)條件為：10 μL樣品注入儀器檢測(cè)，檢測(cè)柱為Aminex HPX-87H Column(Bio-Rad，CA，USA)，0.05 mmol·L-1 H2SO4為流動(dòng)相.洗脫程序?yàn)?.6 mL·min-1 5 min，0.4 mL·min-1 30 min，0.6 mL·min-1 5 min.柱溫40 ℃，檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器.

　　2.3 微生物多樣性分析

　　1)DNA提取及PCR條件 冰凍保存樣品利用淤泥基因組DNA快速提取試劑盒(BioTeke，百泰克生物技術(shù)有限公司，北京)提取總DNA，方法按說(shuō)明.抽提的總DNA利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μL):模板DNA 10 ng，10 ×PCR Gold Buffer 5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2，3 μL，dNTP mix(各2 mmol·L-1)5 μL，45 μmol·L-1 引物(27f和906r)各0. 5 μL，5 Unit Ampli Taq Gold 0. 2 μL.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共22個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min.PCR產(chǎn)物用15 mg·mL-1的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

　　2)變性梯度凝膠電泳(DGGE)提取厭氧消化菌群DNA，利用PCR儀擴(kuò)增菌群16S rDNA基因片段片段(使用引物，細(xì)菌：357F-GC，517 R;古菌：A348IF，U806IR-GC).使用DcodeTM Universal Mutation Detector System(BIO-RAD Laboratories，Hercules，CA，USA)對(duì)所獲DNA片段進(jìn)行凝膠電泳.變性膠1 mm 厚，Polyacrylamide濃度梯度6%~12%(W/V)，0.5× TAB Electrophoresis Buffer(20 mmol·L-1 Tris-HCl，pH值 8.3，10 mmol·L-1 acetic acid，0.5 mmol·L-1 EDTA)，變性劑尿素梯度20%~55%(含有40%甲酰胺，7 mol·L-1尿素).電泳電壓200 V，溫度為61 ℃，時(shí)間5 h.電泳結(jié)束后用SYBR Green I(Molecular Probes，Eugene，OR.)染色，觀察和照相使用Alpha Innotech凝膠成像儀.根據(jù)電泳條帶，分析菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性.

　　3)克隆文庫(kù) 將純化后的PCR產(chǎn)物(使用引物，細(xì)菌：27F，907R;古菌：109F，912R)連接到pGEM-T Easy載體，4 ℃過(guò)夜，然后通過(guò)在42 ℃ 熱激 45 s轉(zhuǎn)化到E.coli JM109菌體內(nèi);通過(guò)X-Gal和IPTG的α-互補(bǔ)作用篩選出白色菌落.并將白色菌落轉(zhuǎn)移到新鮮的含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，編碼建立克隆文庫(kù).利用變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis，DGGE，變性劑濃度范圍設(shè)為20%~60%)篩選出不同種類(lèi)的克隆子.對(duì)含有目標(biāo)克隆子的菌體，用堿裂解法提取質(zhì)粒，并測(cè)序.利用GenBank(NCBI，進(jìn)行相似菌株檢索，獲取近緣菌株相關(guān)序列.應(yīng)用DNA序列分析軟件DNA Star 7.0和MEGA 5.0軟件進(jìn)行序列拼接，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ法).

　　4)定量PCR 古菌總量定量PCR采用Platinum ? SYBR ? Green qPCR SuperMIx-UDG試劑盒.反應(yīng)體系(20μL)為：2×Platinum SYBR ? Green qPCR SuperMix-UDG，10 μL;50 mmol·L-1 MgCl2，1.2 μL;Forward and Reverse specific primers(10 pmol·μL-1)，各0.4 μL;DNA，1 μL;Rox，0.4 μL;PCR grade distilled water 7.8 μL.標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，使用含有被檢測(cè)菌株目標(biāo)片段克隆子的pGEM-T Easy質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用熒光定量?jī)x精確測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度，并計(jì)算其拷貝數(shù).將稀釋成不同數(shù)量級(jí)拷貝數(shù)的梯度標(biāo)準(zhǔn)液，與被測(cè)樣品一同使用ABI Prism ? 7500型熒光定量PCR儀(ABI，USA)進(jìn)行PCR及熒光檢測(cè).擴(kuò)增程序采用ABI儀器的標(biāo)準(zhǔn)程序：50 ℃持續(xù) 2 min(UDG孵育)→ 95 ℃持續(xù)2 min → 40個(gè)循環(huán)：95 ℃，15 s;60 ℃，30 s.熒光檢測(cè)器在60 ℃時(shí)測(cè)定體系熒光強(qiáng)度.數(shù)據(jù)分析，通過(guò)Ct值確定標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)數(shù)值的優(yōu)良，最終獲取待測(cè)樣品拷貝數(shù)(生物量).Methanomicrobiales(MMB)，Methanococcales(MCC)，Methanosaetaceae(MST)分析使用TaqMan ? Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，USA)試劑盒分析，反應(yīng)體系為PCR-grade water，5 μL;Forward and ，各1 μL;對(duì)應(yīng)TaqMan探針(1 μmol·L-1)1 uL;2×TaqMan ? Universal PCR Master Mix，10 μL; DNA，1 μL.其他同Platinum ? SYBR ? Green qPCR SuperMIx-UDG試劑盒反應(yīng).其中MMB退火溫度為63 ℃.

　　3 結(jié)果

　　3.1 高溫馴化過(guò)程中COD、pH值和菌群產(chǎn)沼氣量、甲烷含量變化

　　將來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室的37 ℃條件下運(yùn)行的禽畜糞便厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群直接轉(zhuǎn)移至50 ℃條件下培養(yǎng)，處理高濃度有機(jī)廢水.高溫馴化期間，厭氧消化菌群的產(chǎn)氣量、甲烷含量、pH值及COD等理化特征指標(biāo)被檢測(cè)(圖 2).結(jié)果表明中溫的厭氧產(chǎn)甲烷菌群轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)的前7 d即開(kāi)始產(chǎn)氣，平均日產(chǎn)氣量為115 mL·d-1，20 d后，產(chǎn)氣量進(jìn)入高峰期，平均日產(chǎn)氣量超過(guò)360 mL·d-1.最高日產(chǎn)氣量出現(xiàn)在培養(yǎng)的第31 d，達(dá)到410 mL·d-1(圖 2d).培養(yǎng)期間總計(jì)產(chǎn)氣量為9735 mL(圖 2d)，平均COD轉(zhuǎn)化效率為162.5 mL·g-1.甲烷含量的變化趨勢(shì)與平均日產(chǎn)氣量相似，初期甲烷含量較低(18.9%)，20 d后，甲烷含量維持在34%以上.反應(yīng)器內(nèi)的COD含量在產(chǎn)氣期間穩(wěn)定在6800~7700 mg·L-1(圖 2a)，pH值維持在7.3~8.1之間(圖 2b).4個(gè)參數(shù)的檢測(cè)結(jié)果表明厭氧消化菌群被轉(zhuǎn)至高溫條件下馴化培養(yǎng)，能夠快速啟動(dòng)，并連續(xù)、穩(wěn)定地處理高濃度有機(jī)廢水產(chǎn)生沼氣.

　　圖 2高溫馴化厭氧消化菌過(guò)程中COD、pH值和菌群產(chǎn)沼氣量、甲烷含量變化(注：本研究中0 d樣品為30 ℃培養(yǎng)的原始厭氧消化液，其他時(shí)間為轉(zhuǎn)移至50 ℃后的厭氧消化液樣品，下同.)

　　3.2 高溫馴化厭氧消化菌群過(guò)程中有機(jī)酸含量變化

　　丙酸和乙酸是發(fā)酵液中含量最高的兩類(lèi)有機(jī)酸(圖 3).丙酸含量在啟動(dòng)前期占有明顯的優(yōu)勢(shì)，最高值為784.7 mg·L-1(第15 d)，當(dāng)反應(yīng)器運(yùn)行狀態(tài)穩(wěn)定后，丙酸含量顯著下降，在培養(yǎng)的第30 d，降低至25.3 mg·L-1.乙酸是產(chǎn)甲烷古菌合成甲烷的重要底物，反應(yīng)器內(nèi)乙酸的積累及轉(zhuǎn)化速度常常反應(yīng)了厭氧消化菌群生產(chǎn)甲烷的狀態(tài).在反應(yīng)器啟動(dòng)前期，發(fā)酵液內(nèi)出現(xiàn)乙酸積累現(xiàn)象，并隨培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，在第15 d含量達(dá)到439.3 mg·L-1.進(jìn)入產(chǎn)氣高峰后，反應(yīng)體系內(nèi)的乙酸含量明顯降低，在培養(yǎng)的第30 d，乙酸含量減少至145.3 mg·L-1.甲酸和乳酸在發(fā)酵液中的含量較少，其中乳酸質(zhì)量濃度18~81 mg·L-1之間，甲酸僅在發(fā)酵前期被檢測(cè)到，質(zhì)量濃度約在16~18 mg·L-1之間.

　　圖 3厭氧消化過(guò)程有機(jī)酸含量變化

　　3.3 高溫馴化厭氧消化菌群過(guò)程中菌群結(jié)構(gòu)分析

　　反應(yīng)器運(yùn)行期間，厭氧消化菌群中細(xì)菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)利用DGGE技術(shù)進(jìn)行分析.結(jié)果顯示，在細(xì)菌菌群的DGGE圖譜中，大量的高亮條帶存在于每個(gè)泳道內(nèi)，表明細(xì)菌菌群的多樣性十分豐富(圖 4a、4b)，而古菌菌群的高亮條帶相對(duì)于細(xì)菌菌群明顯減少.在反應(yīng)器運(yùn)行期間，無(wú)論細(xì)菌還是古菌菌群，都存在一些條帶的消失和出現(xiàn)的狀況.在細(xì)菌菌群中約有7個(gè)主要條帶出現(xiàn)(“△”指示部分，下同)，7個(gè)主要條帶消失(“”指示部分，下同);古菌菌群中約有9個(gè)主要條帶出現(xiàn)，4個(gè)主要條帶消失.表明，轉(zhuǎn)變培養(yǎng)溫度后，細(xì)菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)均出現(xiàn)明顯變化，菌群內(nèi)微生物的生物量和種類(lèi)呈現(xiàn)大幅的調(diào)整，以適應(yīng)新的溫度條件.

圖 4 DGGE技術(shù)分析細(xì)菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)(注：a. 細(xì)菌不同培養(yǎng)時(shí)間的DGGE圖像;b. 古菌不同培養(yǎng)時(shí)間的DGGE圖像，“△”指示新增條帶，“ ”指示消失條帶;c. 細(xì)菌DGGE圖像的聚類(lèi)分析;d. 古菌DGGE圖像的聚類(lèi)分析，采用Quantity One 4.3軟件UPGMA分析.)

　　利用Quantity One軟件對(duì)反應(yīng)器菌群DGGE圖片中的條帶圖形進(jìn)行分析，所獲數(shù)據(jù)利用UPGAMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析繪制成系統(tǒng)樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖 4c.細(xì)菌菌群的DGGE圖譜被劃分入4個(gè)族，0、7、15 d圖譜分別屬于A、B、C 3個(gè)族，22、30、39 d圖譜被劃歸入D族，表明在轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)的前22 d，發(fā)酵體系內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整，以適應(yīng)新溫度帶來(lái)的選擇壓力.22 d后，菌群結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定.古菌菌群的DGGE圖譜被劃歸入3個(gè)族(圖 4d)，0 d譜圖劃歸為A族，7 d和15 d圖譜劃歸入B族，22、30和39 d圖譜劃歸入C族.表明改變溫度培養(yǎng)后，古菌菌群結(jié)構(gòu)即產(chǎn)生變化.菌群結(jié)構(gòu)的變化程度弱于細(xì)菌，且變化主要集中在培養(yǎng)的前7 d.與細(xì)菌相似，古菌菌群結(jié)構(gòu)自22 d后進(jìn)入穩(wěn)定階段，直至培養(yǎng)結(jié)束，菌群結(jié)構(gòu)沒(méi)有出現(xiàn)顯著的差異.通過(guò)細(xì)菌和古菌DGGE圖譜變異分析結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)，中溫厭氧消化菌群轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，菌群結(jié)構(gòu)將會(huì)發(fā)生顯著的變異，這種菌群結(jié)構(gòu)的變異將會(huì)持續(xù)20 d左右，這與反應(yīng)體系沼氣產(chǎn)量相吻合(圖 2d).細(xì)菌的變遷程度相對(duì)于古菌更加劇烈，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可能是由于細(xì)菌菌群的多樣性較古菌菌群更為豐富所引起的.這一分析結(jié)果可由針對(duì)DGGE圖譜的主成分分析更為形象的說(shuō)明(圖 5).

　　圖 5(Fig. 5)

　　圖 5細(xì)菌和古菌DEEG條帶變化的主成分分析(注：圖中Ba為細(xì)菌，Ar為古菌，數(shù)值為培養(yǎng)時(shí)間)

　　主成分分析常用來(lái)分析菌群結(jié)構(gòu)變化.在本研究中，細(xì)菌和古菌菌群的分析結(jié)果被提取了3個(gè)主成分，其累積方差為73.2%(主成分1、2、3分別為32.1%、28.1%、13.0%).圖 5為3個(gè)主成分的載荷圖，元素類(lèi)型矩陣.圖中結(jié)果顯示，細(xì)菌菌群和古菌群在圖中能夠較為明顯的被區(qū)分.與古菌菌群相比，細(xì)菌菌群在轉(zhuǎn)變培養(yǎng)溫度后菌群結(jié)構(gòu)方差值更為分散，表明細(xì)菌菌群的結(jié)構(gòu)變異更為強(qiáng)烈.轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，2組菌群的菌群結(jié)構(gòu)與原始培養(yǎng)溫度均產(chǎn)生了明顯的變化，在圖中則表現(xiàn)為0 d的菌菌群結(jié)構(gòu)和后期培養(yǎng)的菌群結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了較遠(yuǎn)的變異距離.

　　3.4 高溫馴化厭氧消化菌群過(guò)程中菌群多樣性分析

　　厭氧消化菌群的16S rRNA基因片段利用克隆方法被獲取，并建立克隆文庫(kù)、繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，獲取菌群內(nèi)菌群多樣性信息.

　　圖 6a顯示厭氧消化菌群中細(xì)菌菌群的系統(tǒng)發(fā)育特征.所有細(xì)菌菌群劃入7個(gè)族，包括Caloramator、Thermoanaerobacter、Peptococcaceae、Thermacetogenium、Acetomicrobium、Soehngenia、Bacteroides.其中Ba4族主要為T(mén)hermacetogenium菌，在菌群中的比例最多，達(dá)到33.44%.第4族中的類(lèi)似菌株Thermacetogenium phaeum strain PB.分離于55 ℃高溫的厭氧反應(yīng)器，能夠與嗜熱氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌共生而氧化乙酸.Bac5在細(xì)菌菌群中的比例約為20.99%.此族的已知代表菌株為Acetomicrobium faecal，該菌發(fā)現(xiàn)于下水道污泥，它能夠代謝多種己糖和戊糖為乳酸、乙酸、乙醇、CO2等.此外，Bac3、Bac1、Bac7等族的菌株在厭氧消化菌群中占有較大比例，分別為13.5%、12.35%、12.34%.它們多數(shù)發(fā)現(xiàn)于高溫厭氧環(huán)境.

　　圖 6細(xì)菌、古菌菌群16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

　　厭氧消化菌群中的古菌菌群被劃分為4個(gè)族(圖 6b)，其中Arc2為4族中最為豐富的古菌菌群，豐度為檢測(cè)古菌總量的56.4%，代表菌株Methanosaeta concili是一類(lèi)能夠利用乙酸作為唯一能源底物代謝產(chǎn)生等量的CH4和CO2.能夠利用甲酸、乙酸和CO2作為碳源而生長(zhǎng).Arc1在古菌clone文庫(kù)中所占的比例為39.75%，代表菌株為Methanoculleus，該菌株能夠利用H2/CO2作為底物而生長(zhǎng)并產(chǎn)生甲烷.一些菌種還需要乙酸作為生長(zhǎng)因子.此外，還有一些厭氧產(chǎn)甲烷古菌及Methanococcus(Arc3和Arc4)被檢測(cè)到，它們?cè)赾lone文庫(kù)中的比例分別為2.56%和1.28%.Jones的研究發(fā)現(xiàn)Methanococcus是一種產(chǎn)甲烷古菌，能夠利用H2和CO2生成甲烷.Arc3中的近緣古菌為Chin所報(bào)道，是通過(guò)克隆文庫(kù)方法于水田土壤中發(fā)現(xiàn)的菌株.

　　可見(jiàn)，轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，菌群中主要的構(gòu)成菌株轉(zhuǎn)換成為能夠在高溫條件下生長(zhǎng)并與糖、多種有機(jī)酸代謝相關(guān)的細(xì)菌菌株以及產(chǎn)甲烷古菌菌株.正是由于這些菌株的穩(wěn)定存在，才能夠維持菌群在高溫條件下穩(wěn)定消化有機(jī)廢水生成沼氣.

　　3.5 高溫馴化厭氧消化菌群過(guò)程中主要菌株的定量分析

　　產(chǎn)甲烷古菌的總生物量及一些典型的產(chǎn)甲烷古菌的生物量可以利用熒光定量PCR方法進(jìn)行定量分析.結(jié)果顯示，厭氧消化菌群從37 ℃轉(zhuǎn)移至50 ℃，產(chǎn)甲烷古菌的總生物量減少(圖 7c)，并在22 d后進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，含量約為7.6×106 拷貝/g活性污泥，相比于中溫培養(yǎng)減少42.2%.利用特異性熒光探針，檢測(cè)了MMB，MCC，MST 3類(lèi)產(chǎn)甲烷古菌，發(fā)現(xiàn)，MMB是一類(lèi)在37 ℃和50 ℃均能檢測(cè)到，并大量存在的產(chǎn)甲烷古菌類(lèi)群，這與董慧峪等(2014)的研究結(jié)果相一致.MCC和MST的生物量在群體中

　　圖 7厭氧消化菌群內(nèi)產(chǎn)甲烷古菌的生物量(注：(a).各類(lèi)菌株的16S rRNA基因拷貝數(shù)占被檢測(cè)總菌株拷貝數(shù)的比例;(b)，(a)放大到0.12%(Y軸)尺度的圖像;(c).產(chǎn)甲烷古菌mcrA基因的拷貝數(shù))

　　較少約占檢測(cè)4種菌株總量的11%，并且在轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)后，其生物量的急劇減少，MCC甚至在菌群穩(wěn)定后消失.表明這2種產(chǎn)甲烷古菌并不適宜于50 ℃條件下生長(zhǎng).Clostridium thermocellum是一株嚴(yán)格厭氧的纖維素分解菌株，廣泛存在于含有纖維素基質(zhì)的厭氧降解環(huán)境.C. thermocellum 是一株能夠在高溫良好生長(zhǎng)的菌株，在本文中，轉(zhuǎn)入高溫后生物量反而小于常溫培養(yǎng)，推測(cè)為厭氧消化體系以不含纖維素糖蜜廢水為主，因缺乏適宜的代謝底物，隨著厭氧消化體系運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)，生物量逐漸衰退.

　　4 討論

　　在厭氧消化過(guò)程，溫度通常是影響微生物菌群的顯著因子，影響微生物的生長(zhǎng)和生存.本研究將37 ℃的厭氧消化菌群直接提溫至50 ℃馴化培養(yǎng)，在溫度和底物的選擇壓力下，原始菌群結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)劇烈的變化調(diào)整后逐漸適應(yīng)新的溫度條件，并具有產(chǎn)甲烷的功能.通常在厭氧消化菌群馴化中，多采用中溫菌群梯度升溫的方法獲得高溫厭氧消化菌群，如歐陽(yáng)二明等等采用序梯度升溫方法將中溫活性污泥(35 ℃)馴化為高溫處理熱水解污泥的菌群.李超偉等以食堂餐廚垃圾為原料，采用中溫沼液作為菌種經(jīng)緩慢升溫成功啟動(dòng)了高溫處理餐廚垃圾的厭氧消化裝置.在本研究中通過(guò)一步直接提溫的方法也可獲得高溫厭氧消化高濃度有機(jī)廢水菌群，這與Ahring、Tian和Raskin的觀點(diǎn)相一致.

　　一些中溫厭氧消化菌群中常存在適宜于高溫生長(zhǎng)的功能菌株，這部分菌株并不會(huì)在中溫條件下的長(zhǎng)期培養(yǎng)而丟失.無(wú)論本研究中將分解禽畜糞便的中溫厭氧消化菌群直接轉(zhuǎn)入高溫培養(yǎng)，獲得高溫厭氧消化菌群，還是利用梯度升溫法獲得高溫厭氧消化菌群，其結(jié)果均能使存在于中溫菌群中的高溫功能菌株活化并富集為優(yōu)勢(shì)菌群而發(fā)揮功能.其區(qū)別在于菌群在溫度改變過(guò)程中所面臨的選擇壓力大小.顯然，直接提升溫度的方法增加了這種選擇壓力.

　　在菌群結(jié)構(gòu)變遷過(guò)程中，細(xì)菌的變化程度較古菌強(qiáng)烈.Gobema等研究認(rèn)為，細(xì)菌具有非常高的多樣性，在常溫厭氧反應(yīng)器內(nèi)，其種類(lèi)豐富程度遠(yuǎn)高于古菌.本研究中，當(dāng)培養(yǎng)溫度提高以后，大量DGGE條帶或消失、或新增，表明菌群內(nèi)一些無(wú)法適應(yīng)新培養(yǎng)溫度菌株的生物量驟減，而適應(yīng)高溫生長(zhǎng)細(xì)菌菌株的生物量增加并占據(jù)了活躍的主導(dǎo)地位.與細(xì)菌菌群相比較，古菌菌群的多樣性變異較為平緩，這除了與古菌種類(lèi)較少(圖 3、5、6)有關(guān)，可能也和古菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢有關(guān).細(xì)菌因其生長(zhǎng)速度快，菌群結(jié)構(gòu)更新周期短，表現(xiàn)為細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)變異劇烈.具體參見(jiàn) 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　5 結(jié)論

　　1) 37 ℃培養(yǎng)的中溫厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群直接轉(zhuǎn)入50 ℃高溫馴化處理高濃度糖蜜有機(jī)廢水，厭氧消化過(guò)程能夠快速啟動(dòng)并生成甲烷，并在22 d后形成穩(wěn)定的高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群，平均甲烷生成效率為162.5 mL·g-1.穩(wěn)定產(chǎn)氣期間乙酸和丙酸的質(zhì)量濃度分別為25.3和145.3 mg·L-1.

　　2) 菌群結(jié)構(gòu)及多樣性在高溫馴化過(guò)程中發(fā)生劇烈變化，細(xì)菌強(qiáng)于古菌，并逐漸穩(wěn)定成為以細(xì)菌(Thermacetogenium，Acetomicrobium)以及產(chǎn)甲烷古菌(Methanosaeta，Methanoculleus)為主要優(yōu)勢(shì)菌群的高溫厭氧消化菌群.

　　3) 所獲高溫厭氧消化產(chǎn)甲烷菌群，其產(chǎn)甲烷古菌的總生物量明顯下降，大約為7.6×106拷貝/g活性污泥.