苯胺類化學(xué)品廣泛用于染料、 農(nóng)藥、 橡膠以及油漆的制造中[1, 2, 3]，此類化學(xué)品易隨著工業(yè)廢水、 農(nóng)業(yè)徑流水、 生活污水排放到環(huán)境中，對(duì)水生生物和人體健康產(chǎn)生潛在危害[4, 5].

　　化學(xué)品在環(huán)境中的去除途徑主要有揮發(fā)、 水解、 吸附[6, 7]和生物降解. 由于苯胺類化學(xué)品亨利常數(shù)較低，且不含有易于水解的官能團(tuán)，揮發(fā)和水解并非其在污水處理廠中的主要去除過(guò)程[8]，而主要是以生化作用去除含苯胺類化學(xué)品的廢水[9, 10]. 在以生化方法為主要工藝的污水處理廠中，pH、 溫度、 微生物活性、 活性污泥濃度以及水力停留時(shí)間等條件對(duì)化學(xué)品的去除過(guò)程影響較大[11]. 因此研究苯胺類化學(xué)品在污水處理廠中的歸趨過(guò)程，對(duì)于評(píng)估其環(huán)境暴露，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)防控具有重要意義.

　　生物降解性測(cè)試目前普遍采用經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織提出的化學(xué)品生物降解性測(cè)試導(dǎo)則，包括快速生物降解性301、 固有生物降解性302和模擬生物降解性303A[12]，利用這種層層遞進(jìn)的方式來(lái)評(píng)估其在環(huán)境中的歸趨過(guò)程. 模擬生物降解303A與快速生物降解性測(cè)試(301系列)的不同之處在于測(cè)試過(guò)程中活性污泥的濃度高低以及活性污泥是否經(jīng)過(guò)馴化等; 模擬生物降解303A是更高水平的測(cè)試，更接近于實(shí)際情況，比快速生物降解性301、 固有生物降解性302的結(jié)果更真實(shí)和可靠[13]，能為評(píng)估化學(xué)品在污水處理廠的去除和歸趨提供有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[14].

　　4-硝基苯胺以及氯代苯胺是一類典型的苯胺取代物，可以通過(guò)皮膚以及眼睛滲透進(jìn)動(dòng)物體，具有潛在的致癌以及誘發(fā)基因突變[15, 16]的嚴(yán)重影響，近年來(lái)許多國(guó)家將此類物質(zhì)列為優(yōu)先污染物[17, 18]，4-異丙基苯胺主要來(lái)源于除草劑異丙隆的合成和代謝[19]，但是關(guān)于它們的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)影響現(xiàn)在文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道，因此，本文在303A方法的基礎(chǔ)上著重研究了不同水力停留時(shí)間條件下4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺和2-氯-4-硝基苯胺的生物降解性，探討了這3種化學(xué)品的生物降解動(dòng)力學(xué)及降解影響因素，以期為此類化學(xué)品的環(huán)境暴露評(píng)估以及廢水處理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù).

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與試劑

　　好氧生化污水處理模擬系統(tǒng)見(jiàn)圖 1; 液質(zhì)聯(lián)用儀(; TOC分析儀(3100，耶拿，德國(guó)); 分析天平(MS105DU，梅特勒，瑞士); 高速冷凍離心機(jī); 水質(zhì)多參數(shù)測(cè)定儀(HQ 40d，哈希，美國(guó)); 純水器.

　　A. 貯存罐; B.進(jìn)水泵; C.曝氣罐(4.5 L); D.沉降池(2.3 L); E.回流泵; F.收集罐圖 1 好氧生化污水處理模擬系統(tǒng)

　　4-硝基苯胺(CAS:100-01-6，分析純); 4-異丙基苯胺(CAS：99-88-7，分析純); 2-氯-4-硝基苯胺(CAS:121-87-9，分析純)均購(gòu)自百靈威化學(xué). 甲醇(色譜純，Merck KGaA).

　　實(shí)驗(yàn)中的活性污泥采自南京某生活污水處理廠的曝氣池.

　　1.2 好氧生化污水處理模擬實(shí)驗(yàn)方法

　　生化污水處理模擬系統(tǒng)(如圖 1)放置于室溫(25℃±0.2℃)避光環(huán)境中，將活性污泥懸浮液(3 g ·L-1)接種于曝氣罐中，開(kāi)啟電源及曝氣泵，連續(xù)充氧. 并加入適量合成污水(牛肉浸膏11 g ·L-1，蛋白胨16 g ·L-1，尿素3g ·L-1，NaCl 0.7 g ·L-1，CaCl2 ·H2O 0.4g ·L-1，MgSO4 ·7H2O 0.2 g ·L-1，磷酸氫二鉀 2.8 g ·L-1)[20]作為提供活性污泥生長(zhǎng)的能源.

　　實(shí)驗(yàn)期間不斷向貯存罐中加入含苯胺類化學(xué)品和合成污水，保持進(jìn)水苯胺類化學(xué)品的濃度為1 mg ·L-1且溶解性有機(jī)碳濃度為100 mg ·L-1. 開(kāi)啟進(jìn)水提升泵和污泥回流泵，初始實(shí)驗(yàn)溶液以420 mL ·h-1的流速進(jìn)入曝氣罐中，平均水力停留時(shí)間(HRT)約為11.2 h，污泥停留時(shí)間為8 d. 當(dāng)化學(xué)品去除率達(dá)到穩(wěn)定后，調(diào)整進(jìn)水泵轉(zhuǎn)速改變水力停留時(shí)間(6、 12和24 h)繼續(xù)測(cè)試. 實(shí)驗(yàn)期間，每天測(cè)定曝氣罐中活性污泥懸浮固體的濃度，并定期去除回流的剩余污泥，使污泥濃度穩(wěn)定在3 g ·L-1.

　　實(shí)驗(yàn)期間，定期取進(jìn)水及出水各10 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，加200 μL 0.1 mol ·L-1鹽酸酸化去除水樣中無(wú)機(jī)碳后，用TOC分析儀測(cè)定DOC，每個(gè)樣品3個(gè)平行. 使用水質(zhì)多參數(shù)測(cè)定儀測(cè)定曝氣罐中pH、 溶解氧(DO). 從曝氣罐中收集100 mL污泥，高速離心機(jī)(10 000 r ·min-1)離心5 min后棄去上清液，將下層污泥團(tuán)稱重后置于105℃中烘干、 稱重，差值法計(jì)算混合液中的懸浮固體含量.

　　LC-MS/MS方法：取進(jìn)水、 出水以及回流污泥樣品，加入等體積的甲醇超聲25 min后過(guò)0.22 μm濾膜后，采用電噴霧離子源、 負(fù)電離模式、 多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)掃描定量分析目標(biāo)物. 氣簾氣壓350 000 Pa，噴霧氣壓379 214 Pa，輔助加熱氣壓413 688 Pa，源溫度450℃，離子化電壓5 500 V. 選擇ZORBAX Eclipse Plus C18 Column (150 mm×2.1 mm，3.5 μm，Agilent，USA)分離樣品. 流動(dòng)相2 mmol ·L-1甲酸銨水溶液(A)和乙腈(B)，以0.5 mL ·min-1流速進(jìn)行梯度洗脫，進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫條件見(jiàn)表 1.

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　　表 1 梯度洗脫程序

　　1.3 生物降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)方法

　　模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，此時(shí)活性污泥已對(duì)苯胺類化學(xué)品完全適應(yīng)，從曝氣罐中取200 mL活性污泥懸浮液，使用高速冷凍離心機(jī)(5 000 r ·min-1)離心5min后棄去上清液，然后用去離子水重新溶解污泥團(tuán)，充分混勻分散后重復(fù)上述步驟至少3次，從而盡可能地完全洗滌污泥中的污染物，最后用去離子水將潔凈的污泥配制成3 g ·L-1的懸浮液. 向其中添加3種苯胺類化學(xué)品，濃度為1 mg ·L-1，持續(xù)攪拌培養(yǎng)，確保溶解氧達(dá)到2 mg ·L-1以上，在36 h內(nèi)定時(shí)取樣并測(cè)定污泥懸浮液中的化學(xué)品濃度.

　　1.4 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

　　采用Office Excel表格計(jì)算與處理數(shù)據(jù)，涉及的主要計(jì)算如下.

　　1.4.1 DOC去除率計(jì)算

　　式中,Dt為系統(tǒng)中t時(shí)刻DOC去除率(%); ci為進(jìn)水DOC質(zhì)量濃度(mg ·L-1); ce為出水時(shí)的DOC質(zhì)量濃度(mg ·L-1).

　　1.4.2 化學(xué)品去除率計(jì)算

　　式中,R為化學(xué)品去除率(%); STi 為進(jìn)水化學(xué)品質(zhì)量濃度(mg ·L-1); STe為出水時(shí)化學(xué)品質(zhì)量濃度(mg ·L-1).

　　1.4.3 化學(xué)品去除動(dòng)力學(xué)計(jì)算

　　d=d0e-kt (3) 式中,d為t時(shí)刻化學(xué)品的殘留百分比(%); d0為化學(xué)品初始的殘留百分比(%); k為反應(yīng)速率(h-1); t為時(shí)間(h).

　　式中,DT50為化學(xué)品濃度減少一半的時(shí)間(h); k為反應(yīng)速率(h-1).

　　所得數(shù)據(jù)采用Origin8繪圖軟件作圖.

　　2 結(jié)果與討論 2.1 生化污水處理模擬系統(tǒng)運(yùn)行情況

　　活性污泥中含有大量微生物，微生物活性對(duì)化學(xué)品生物降解性結(jié)果影響顯著. 模擬系統(tǒng)中DOC去除率，是反映微生物活性以及系統(tǒng)是否運(yùn)轉(zhuǎn)正常的重要指標(biāo)，不同HRT(6、 12、 24 h)對(duì)系統(tǒng)DOC去除的結(jié)果見(jiàn)圖 2. HRT為6、 12和24 h時(shí)，系統(tǒng)DOC平均去除率從70.2%依次增加至80.3%、 88.3%. HRT較短時(shí)，化學(xué)品與微生物接觸時(shí)間較短，還未充分生物利用就被排出系統(tǒng)，增加HRT可以促進(jìn)化學(xué)品的降解; 但是實(shí)際污水處理廠中，需根據(jù)進(jìn)水量、 進(jìn)水水質(zhì)、 處理能力、 運(yùn)行成本等多方面因素綜合設(shè)定合適的HRT.

　　圖 2 不同水力停留時(shí)間下的DOC去除率

　　污水處理廠曝氣池pH是影響生物降解性的重要影響因素，pH過(guò)高不利于污泥生長(zhǎng)，還會(huì)破壞新生的污泥[21]; pH值過(guò)低時(shí)菌膠團(tuán)生長(zhǎng)受到抑制，而真菌生長(zhǎng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，污泥絮體將遭到破壞和污泥膨脹等[22]. 通常在好氧生化反應(yīng)池中，能降解硝基苯類化合物的優(yōu)勢(shì)菌屬最適的pH為6.5~8.5[3, 23]，由圖 3可見(jiàn)，本模擬實(shí)驗(yàn)曝氣罐中pH維持在6~8，適宜開(kāi)展苯胺類化學(xué)品的生物降解研究.

　　在好氧生化反應(yīng)池中，溶解氧是反映一個(gè)好氧系統(tǒng)生物活性能力的重要參數(shù)，溶解氧濃度要達(dá)到2 mg ·L-1以上時(shí)，才能為好氧菌群提供充足的氧. 如圖 3所示，實(shí)驗(yàn)期間，氧化罐中溶解氧初始值為4.4 mg ·L-1，隨著系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后逐步穩(wěn)定在8.5 mg ·L-1，由于本模擬系統(tǒng)較小，通過(guò)連續(xù)曝氣，溶氧濃度較易控制.

　　圖 3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溶解氧和pH變化

　　2.2 HRT對(duì)苯胺類化學(xué)品去除率的影響

　　在好氧生化污水處理模擬系統(tǒng)中，HRT是影響化學(xué)品去除率的重要因素，它是可以人為調(diào)控的關(guān)鍵參數(shù). HRT過(guò)大會(huì)使有機(jī)質(zhì)過(guò)度增長(zhǎng)從而對(duì)微生物產(chǎn)生聚集和毒性影響，HRT過(guò)短會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌分散沖蝕[24]，因此有必要通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究獲取合適的水力停留時(shí)間，從而維持系統(tǒng)的穩(wěn)定運(yùn)行以及準(zhǔn)確的化學(xué)品去除率.

　　實(shí)驗(yàn)期間，通過(guò)調(diào)節(jié)水力停留時(shí)間(12、 24、 6 h)，分析進(jìn)、 出水苯胺類化學(xué)品的去除率. 結(jié)果顯示見(jiàn)圖 4，初始HRT設(shè)置為12 h時(shí)，3種化學(xué)品12~15 d去除率非常低，其中2-氯-4-硝基苯胺和4-硝基苯胺去除率基本為0，4-異丙基苯胺去除率約為15%. 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始21 d后，3種物質(zhì)開(kāi)始有了明顯的去除，其中2-氯-4-硝基苯胺去除率不穩(wěn)定，在0和15%之間波動(dòng); 4-硝基苯胺去除率從28%上升至88%，平均去除率約為64.7%; 4-異丙基苯胺去除率從30%上升至98%，平均去除率約為76%. 這3種化學(xué)品出現(xiàn)較長(zhǎng)的降解停滯期(12~15 d)，在此期間，微生物可能需適應(yīng)此類化學(xué)品，同時(shí)也可能是降解優(yōu)勢(shì)菌種的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期.

　　實(shí)驗(yàn)開(kāi)始34 d后，將HRT由12 h調(diào)節(jié)為24 h，4-硝基苯胺去除率增加并維持在69%~89.4%; 4-異丙基苯胺去除率上升至79%~99%，它們的平均去除率分別為75%和91%. 2-氯-4-硝基苯胺去除率仍然很低，去除率約為11%.

　　實(shí)驗(yàn)開(kāi)始62 d后，將HRT由24 h調(diào)節(jié)為6 h，4-硝基苯胺去除率降低至55%，此后去除率在35%~56%范圍波動(dòng)，平均去除率為48%. 4-異丙基苯胺去除率降至59%，此后去除率在48%~75%范圍波動(dòng)，平均去除率為66%. 2-氯-4-硝基苯胺在HRT為6 h時(shí)，去除率低于15%.

　　分析可知，當(dāng)微生物適應(yīng)3種苯胺類化學(xué)品后，HRT為12h和24 h時(shí)，4-硝基苯胺和4-異丙基苯胺的平均去除率均可達(dá)到80%; HRT為6 h時(shí)，4-硝基苯胺和4-異丙基苯胺去除率顯著降低，且去除率穩(wěn)定性降低; 2-氯-4-硝基苯胺則在所有條件下都未觀察到明顯的去除. 本研究表明在好氧污水處理系統(tǒng)中，HRT為24 h時(shí)可以有效且穩(wěn)定去除苯胺類化學(xué)品.

　　圖 4 苯胺類化學(xué)品在不同水力停留時(shí)間的降解速率曲線

　　亨利常數(shù)(H)可用于表征化學(xué)品在水氣界面之間的分配過(guò)程，根據(jù)Whiteman雙阻力理論，當(dāng)化學(xué)品H=2.5 Pa ·(m3 ·mol)-1時(shí)，化學(xué)品從水相遷移至氣相時(shí)，水相的阻力為氣相阻力的十分之一，揮發(fā)速率可以忽略[25]. 4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺以及2-氯-4-硝基苯胺H分別為0.035、 0.5和9.67×10-4 Pa ·(m3 ·mol)-1，它們的H遠(yuǎn)小于2.5 Pa ·(m3 ·mol)-1[26]，因此在曝氣過(guò)程中的揮發(fā)性損失可以忽略. 當(dāng)化學(xué)品吸附系數(shù)(lgkoc)大于3.3時(shí)，化學(xué)品可能會(huì)顯著地吸附于污泥中并隨剩余污泥排出系統(tǒng)[27]，4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺以及2-氯-4-硝基苯胺的lgkoc分別為1.64、 2.53、 2.25，不具有顯著吸附性. 此外，有文獻(xiàn)提到自然界中的硝基類芳香化合物以及2-氯-4硝基苯胺只有通過(guò)人工催化發(fā)生光氧化反應(yīng)，并且自發(fā)的光降解反應(yīng)對(duì)污染物去除的貢獻(xiàn)值極低[28, 29]，好氧生化污水處理系統(tǒng)位于較暗的室內(nèi)環(huán)境，因此由光照引起的化學(xué)品輕微的降解可以忽略. 綜上，可以初步確定本研究中3種化學(xué)品在系統(tǒng)中的去除主要源自于生物降解.

　　2.3 苯胺類化學(xué)品的生物降解動(dòng)力學(xué)

　　模擬生物降解性303A實(shí)驗(yàn)方法只能得到化學(xué)品的去除率結(jié)果，無(wú)法得到化學(xué)品生物降解速率和降解動(dòng)力學(xué)信息，而該信息在化學(xué)品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中可用于評(píng)估環(huán)境暴露水平. 本研究使用模擬實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)完全馴化和適應(yīng)的活性污泥測(cè)定過(guò)的3種苯胺類化學(xué)品的生物降解動(dòng)力學(xué)參數(shù). 由圖 5降解曲線可知，4-硝基苯胺和4-異丙基苯胺易降解，36 h后生物降解率分別為80%和98%; 2-氯-4-硝基苯胺生物降解速率極低，36 h后生物降解率為20%.

　　圖 5 3種化學(xué)品的降解動(dòng)力學(xué)曲線

　　化學(xué)品降解通常遵循一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，表 2列出了按照一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合的3種化學(xué)品的動(dòng)力學(xué)去除方程、 降解速率常數(shù)以及半衰期. 3種化學(xué)品一級(jí)動(dòng)力學(xué)曲線擬合相關(guān)性均在0.95以上. 4-異丙基苯胺、 4-硝基苯胺和2氯-4-硝基苯胺在好氧生化活性污泥中的降解半衰期分別為6.01、 16.16和123.75 h. 有研究表明，在好氧條件下適當(dāng)濃度的硝基芳香化合物可以發(fā)生降解[30]，Khalid等[31]通過(guò)混合培養(yǎng)不動(dòng)桿菌等3種微生物去除染料廢水中4-硝基苯胺，發(fā)現(xiàn)初始濃度為100 μmol ·L-1的4-硝基苯胺在72 h內(nèi)可完全去除，楊彬等[32]研究也表明4-硝基苯胺在好氧條件下具有較高的降解速率，與本研究結(jié)果一致.

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　　表 2 3種化學(xué)品動(dòng)力學(xué)方程、 降解速率與半衰期

　　OECD 303A實(shí)驗(yàn)?zāi)M了真實(shí)的生物質(zhì)與受試物濃度[33]，能客觀評(píng)估苯胺類化學(xué)品在污水處理階段的歸趨，通常3 g ·L-1的活性污泥濃度是好氧降解條件下微生物的最高濃度，而在地表水等其他環(huán)境中微生物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于此濃度. 有研究認(rèn)為化學(xué)品生物降解速率正比于微生物的細(xì)胞數(shù)量[34]，因此也可據(jù)此將本研究中化學(xué)品在好氧活性污泥中的降解速率外推獲得在地表水等環(huán)境中的生物降解速率.

　　2.4 苯胺類化學(xué)品取代基對(duì)生物降解性的影響

　　有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)決定了其在環(huán)境中的生物降解性. 苯胺是易于生物降解的化學(xué)品，本研究中3種取代苯胺所含的官能團(tuán)有—NO2、 —Cl和異丙基，它們的生物降解速率從高到低依次為，4-異丙基苯胺>4-硝基苯胺>2-氯-4-硝基苯胺. 通過(guò)定量結(jié)構(gòu)與生物降解性關(guān)系[35]研究發(fā)現(xiàn)，異丙基對(duì)化學(xué)品生物降解起著積極的作用[36]，而—NO2、 —Cl等基團(tuán)吸電子能力強(qiáng)，會(huì)降低微生物中酶的活性，阻礙化學(xué)品的生物降解性[37]. 因此，4-硝基苯胺的生物降解速率比4-異丙基苯胺小. 2-氯-4-硝基苯胺未發(fā)現(xiàn)明顯的生物降解也是因?yàn)楸江h(huán)上同時(shí)引入氯原子及硝基2個(gè)吸電子基團(tuán)后，苯環(huán)電子云密度減小，導(dǎo)致微生物及相關(guān)酶的親電攻擊性減弱，此外由于碳-氯鍵的牢固性，使得此類物質(zhì)難以降解[6]. 化學(xué)品自身組成對(duì)它們生物降解性的影響有待進(jìn)一步研究.

　　此外，—NO2、 —Cl等基團(tuán)對(duì)微生物還有一定的毒性作用，本研究中添加的實(shí)驗(yàn)濃度較低(1 mg ·L-1)，避免了較高濃度下對(duì)微生物產(chǎn)生的毒性抑制作用，因此本研究中得到的苯胺類化學(xué)品的生物降解結(jié)果更能反映它們?cè)谡鎸?shí)環(huán)境條件下的情形.具體參見(jiàn) 污水處理技術(shù)資料或污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結(jié)論

　　(1)提高HRT可促進(jìn)DOC以及苯胺類化學(xué)品的去除. HRT為6、 12和24 h時(shí)，系統(tǒng)DOC去除率依次為70.2%、 80.3%和88.3%; 4-硝基苯胺去除率分別為48%、 64.7%和75%; 4-異丙基苯胺的去除率分別為66%、 76%和91%. 2-氯-4-硝基苯胺在不同HRT條件下，較難去除，去除率平均值低于20%.

　　(2)4-硝基苯胺、 4-異丙基苯胺和2-氯-4-硝基苯胺的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，回歸系數(shù)皆大于0.95，生物降解半衰期分別為6.01、 16.16和123.75 h.

　　(3)苯胺類化學(xué)品取代基對(duì)好氧生物降解性影響顯著，異丙基對(duì)降解有積極作用，硝基和氯原子等基團(tuán)抑制生物降解.（來(lái)源及作者：南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院 古文 徐炎華 陳國(guó)松 環(huán)境保護(hù)部南京環(huán)境科學(xué)研究所 劉濟(jì)寧 陳國(guó)松 周林軍 石利利）