城市污水管網是一個收集、 運輸城市污水的系統，是城市水利基建的重要組成部分[1]. 然而，污水在管網內的運輸過程中水質發生了變化，生化需氧量(BOD)、 化學需氧量(COD)會有不同程度的變化[2~6]，溶解性有機碳(DOC)也存在著降低的現象[7~9]. 同時，在污水運輸過程中，還發現管網的管壁上有生物膜的形成[10~12]，由此人們開始關注污水管網中微生物對水質的改變作用.

　　在城市污水管網中，由于污水中含有揮發性脂肪酸(VFA)等物質，為產甲烷過程提供了物質基礎[13~15]. 先前研究發現，在管網中，確實有CH4的產生[16~18]. 管網中CH4的產生對管網的運行管理和污水處理帶來極大的隱患. CH4是一種溫室氣體，管網中的CH4排放到空氣當中會加劇溫室效應[19, 20]; 當管網內CH4濃度超過5%時有爆炸的危險[21, 22]; 管網內CH4的產生會帶走一部分COD，這不利于后續污水處理廠的生物脫氮除磷的過程[23, 24]，因此管網中CH4的產生是值得關注的問題. CH4的產生與管網中的產甲烷菌有關，因此研究管網中的產甲烷菌也具有重要意義. 然而，目前對管網內產甲烷菌的演替規律了解甚少.

　　基于此，本文通過建立一套1 200 m管道系統，對污水管網內CH4沿程變化及產甲烷菌的分布特性進行研究，并探明了產甲烷菌可利用基質與產甲烷菌分布之間的關系.

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗條件和原水水質

　　反應器為城市污水模擬管網反應器[25]，以西安市城市污水作為原水，在室溫下運行，實驗溫度為(25±2)℃，pH為7.2±0.3，密封性良好. 管網沿程的溶解氧(DO)為(0.3±0.05)mg ·L-1，沿程變化不大，總體變化趨勢為沿程降低，且由于管網始端和末端暴露在空氣中，溶解氧相對含量較高，溶解氧沿程變化如圖 1所示.

　　圖 1 管網沿程中溶解氧的變化

　　在反應器連續運行期間，通過控制管網坡度為5‰和污水充滿度0.6，來使污水流速為0.6m ·s-1，水力停留時間為1h. 污水依靠重力進入模擬管段. 在反應器連續運行期間，原水的水質狀況如表 1所示.

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　　表 1 城市污水管網中的水質特性

　　1.2 取樣方法

　　在800 m的管網系統中選取8個取樣點，其中選取原水作為0 m處的取樣點，然后一次在分別選取30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m處作為剩余的8個取樣點進行水質分析，分析指標包括COD、 氨氮(NH+4-N)、 總氮(TN)、 總磷(TP)等常規指標及發酵產物. 對于生物分析所需要的生物膜樣品采集，以30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m作為生物膜取樣點. 首先將8個位置的管段兩端的活結松開，取下管段，將管段里的有機玻璃條取出，用無菌棉簽將適量的生物膜從有機玻璃載體上刮入一次性培養皿中并將培養皿蓋好，然后立即放入裝有干冰的保溫盒并送至實驗室-20℃保存.

　　1.3 分析方法

　　1.3.1 乙酸分析

　　水樣分析之前用3%的磷酸將水樣的pH調節到4左右，再將水樣用0.45 μm濾膜過濾. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 氫火焰離子化檢測器，色譜柱為DB-FFAP(30 m×0.5 μm×0.32 mm). 升溫程序： 初始柱溫100℃保持2 min，以10℃ ·min-1的速度升至120℃保持2 min，再以6℃ ·min-1升至200℃保持2 min. 進樣口溫度200℃，檢測器溫度230℃，進樣量1 μL. N2作為載氣和補償氣，速率均為20mL ·min-1. H2速率為35mL ·min-1，空氣為350mL ·min-1.

　　1.3.2 甲醇分析

　　測定甲醇和乙醇的濃度選用方法為氣相色譜法，進樣方式為頂空進樣. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津)，色譜柱為CB-5(30 m×0.5 μm×0.32 mm)，FID檢測器，并配有AOC-5000頂空自動進樣器. 升溫程序： 50℃保持5 min，以5℃ ·min-1的速度升至100℃，保持2 min，以5℃ ·min-1的升溫速度升至200℃. 進樣口溫度為200℃，檢測器溫度為280℃; 載氣流量為5.0mL ·min-1; 分流比2 ∶1. 頂空自動進樣器條件： 加熱平衡溫度為80℃，加熱平衡時間30 min; 取樣針溫度為90℃; 進樣體積1.0 mL.

　　1.3.3 甲酸分析

　　分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測器，波長設置為210 nm. 流動相為0.02mol ·L-1 KH2PO4 ∶甲醇(體積比為95 ∶5)，用磷酸調節pH到2. 流速設置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進樣體積10 μL.

　　1.3.4 甲胺分析

　　甲胺濃度采用液相色譜法進行測定. 上機測樣之前對樣品進行PITC衍生化處理，并用C18柱進行固相萃取. 分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測器，波長設置為240 nm. 流動相為乙腈 ∶水(體積比為30 ∶70)，流速設置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進樣體積10 μL.

　　1.3.5 CH4分析

　　CH4的測定選用氣相色譜法，分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 檢測器為熱導檢測器(TCD)，色譜柱型號為TDX-01填充柱. 柱溫設置為100℃，保持10 min. N2作為尾氣，流速為10.0mL ·min-1. Ar作為載氣，流速為48mL ·min-1. 使用標準氣體混合氣校準，其組分為37% CO2、 4% N2、 0.802% H2以及CH4.

　　1.3.6 其他水質分析

　　實驗中COD、 NH+4-N、 TN和TP的測定采用國家標準方法.

　　1.3.7 DNA提取和PCR擴增

　　采用Power Soil DNA提取試劑盒(MO Biomedical,U.S.)對生物膜樣本中的DNA進行提取，提取方法按照試劑盒制造商提供的方法使用說明書進行. 對于產甲烷菌基因片段的擴增，選用特異性引物MLf 5′- GGTGGTGTMGGATTCACACARTA YGCWACAGC-3′和MLr 5′- TTCATTGCRTAGTTW GGRTAGTT- 3′[26]. PCR反應體系(20 μL)： 5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，引物各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加無菌水至20 μL. PCR條件： 95℃預變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環，最后72℃延伸5 min. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物.

　　1.3.8 產甲烷菌454高通量測序

　　用AeyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，并用2%瓊脂糖電泳檢測. 參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序要求，進行相應比例的混合. 用Roche GS FLX Titanium emPCR試劑盒對混合物進行emPCR擴增，擴增后的混合物按照454平臺的標準方法，在Roche 454 GS FLX+Titanium平臺上進行上機測序.

　　2 結果與分析

　　2.1 管網系統中CH4氣體的產生

　　圖 2中展現了管網中CH4的含量的變化趨勢，結果表明CH4含量較低均在3%以下，遠小于50%，所以管網內甲烷化程度較低[27]. 從中可以看出，CH4在管網中的變化規律是沿程增加的. 在0~30 m處，沒有CH4的產生，這可能由于在管網始端，污水中溶解氧含量較高，不適合產甲烷菌富集生長，此外污水中的有機物質以大分子有機物為主，這些大分子有機物質無法被產甲烷菌直接利用. 隨著管網沿程距離的不斷增加，管道內CH4的含量也不斷升高，在1 200 m處達到最大值，其含量為2.75%. CH4含量沿程升高，這是由于管道內的水解發酵過程使得大分子物質轉化為VFA(乙酸)等小分子物質，產甲烷菌得以不斷利用乙酸等可利用基質，使得CH4在管網中不斷產生并得到積累，故管網中的CH4含量隨之升高.

　　圖 2 管網沿程中CH4含量的變化

　　2.2 管網系統中產甲烷菌的沿程分布特性 2.2.1 管網系統中產甲烷菌的構成及多樣性分布

　　表 2反映了管網中產甲烷菌的構成及其相對豐度情況，從中可以看出，管網中檢測到的產甲烷菌共有9種，其中甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬、 甲烷桿菌科中的菌屬和古菌門中的菌屬在管網中始終存在.

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　　表 2 管網中產甲烷菌的構成1)/%

　　圖 3展現了管網沿程產甲烷菌的多樣性變化. Shannon指數是表征物種多樣性的指標[28]，因此在圖 3中是通過Shannon指數來反映產甲烷菌的多樣性變化. 由于在管網初始端30 m處的生物膜樣本中沒有生成有效序列，即在30 m處沒有檢測到產甲烷菌，故30 m處不存在產甲烷菌，這可以很好地解釋圖 2中30 m處沒有CH4的生成. 從中可以看出，100~600 m之間Shannon指數沿程降低，由100 m處的2.7降低至600 m處的1.58，600~800 m處的Shannon指數保持穩定，說明管網800 m之前產甲烷菌的多樣性沿程降低，且在600~800 m之間保持穩定; 在管網1 000 m處，Shannon指數突然升高，此后一直保持穩定，Shannon指數穩定在2.2左右，說明管網末端多樣性較為豐富且保持穩定.

　　圖 3 產甲烷菌多樣性在管網中的沿程變化

　　2.2.2 管網系統中產甲烷菌菌群結構分析

　　圖 4所示的是產甲烷菌的熱圖分析，是在屬水平下進行的分析，不同的顏色代表了不同的相對豐度值，藍色相對豐度最低，紅色相對豐度最高，圖頂的分支表示了樣本之間的結構相似性. 由于30 m沒有產甲烷菌，因此管網30 m處的樣本不參與熱圖分析. 圖 4中聚類結果表明，管網100~1 200 m中的產甲烷菌群落結構共分為兩大類，其中200~800 m為一類，100、 1 000和1 200 m為一類. 200~800 m這一類中，600 m和800 m中的群落結構最為相近，而在100、 1 000和1 200 m的這一類中，以1 000 m和1 200 m的群落結構最為相似; 在800 m和1 000 m這一相鄰位置處，群落結構發生了明顯的改變，說明在該處存在著產甲烷菌的演替現象. 同時，根據圖中的顏色分布可以看出，在管網中的優勢菌群有甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，其中甲烷八疊球菌屬和廣古菌門中的菌屬為主要優勢菌群.

　　圖 4 產甲烷菌聚類(熱圖)分析

　　2.2.3 產甲烷菌的菌屬演替過程

　　優勢菌群是一個群落中的主要構成部分，基于1.2.2節的結果對管網中的優勢產甲烷菌進行進一步的分析. 圖 5反映了管網中優勢產甲烷菌相對豐度的沿程變化，結果表明，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，這3種產甲烷菌相對豐度變化規律較為明顯. 在管網30 m處，3種菌屬都不存在，在管網100~800 m范圍內，甲烷八疊球菌屬的相對豐度在3種優勢菌屬中最高，且隨著管網距離的增加相對豐度也不斷增加，與之相反，廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在管網100~800 m的范圍內相對豐度的沿程變化趨勢與甲烷八疊球菌屬嚴格相反，它們的相對豐度在管網中沿程降低，其中甲烷桿菌科中的菌屬在600~800 m之間失去優勢地位，相對豐度均在0.7%以下; 在管網1 000~1 200 m范圍內，甲烷八疊球菌屬的相對豐度降低并保持穩定，廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬相對豐度升高并保持穩定，其中廣古菌門中的菌屬)超過甲烷八疊球菌屬成為3種菌屬中相對豐度最高的菌屬. 從圖 5中可以看出，600 m和800 m、 1 000 m和1 200 m的優勢菌屬的相對豐度變化不大，這與圖 4中的群落結構分析可以很好地對應起來，也說明了群落中的優勢菌屬的構成基本反映了群落結構的構成情況. 同時，在800~1 000 m的過程中，3種產甲烷菌的相對豐度、 優勢地位和變化趨勢都發生了改變，說明在該管網范圍內，產甲烷菌群中菌屬發生了演替過程，即在該處廣古菌門中的菌屬取代了甲烷八疊球菌屬成為第一優勢菌屬.

　　圖 5 優勢產甲烷菌相對豐度在管網中的沿程變化

　　2.3 產甲烷菌可利用基質的變化規律

　　圖 6反映了產甲烷菌可利用基質的變化情況. 管道中存在的產甲烷菌可利用基質有甲酸、 甲醇、 甲胺、 乙酸(“三甲一乙”)和H2，其中乙酸的含量最高，而甲胺的含量極低. 由于H2是氣相產物且在管網中的含量很低，本文對H2不做過多論述. “三甲一乙”這4種基質在管網中的變化規律基本一致，均呈現出先增加后降低的變化趨勢.

　　圖 6 管網中產甲烷菌可以用基質的沿程變化

　　乙酸在整個管網中含量最高，在管網0~600 m沿程增加并在600 m處達到最大值8.67mg ·L-1，并在600~800 m處保持穩定，而后開始沿程逐漸下降; 甲酸在管網0~400 m沿程增加并在400 m處達到最大值3.64mg ·L-1，而后開始沿程降低; 甲醇在30 m處達到最大值2.17mg ·L-1后開始沿程降低; 而甲胺在整個管網中的含量之中保持在很低的水平且濃度不超過0.015mg ·L-1，在800 m處含量最高0.011mg ·L-1. 這4種基質在管網中均存在含量降低的現象，說明這4種基質在管網中都被產甲烷菌利用生成CH4. 在管網中，乙酸是含量最高的產甲烷可利用基質，即產甲烷菌可以利用的乙酸多，且根據厭氧三階段理論，在發酵產甲烷過程中72%的CH4主要來自于乙酸[29]，說明在管網中產甲烷菌主要利用乙酸. 管網中0~800 m處甲烷八疊球菌屬相對豐度最高，主要利用乙酸生成CH4[30, 31]，甲烷八疊球菌屬的相對豐度在該范圍內沿程增加，這很好地解釋了在0~800 m乙酸含量的變化情況，且600~800 m乙酸含量保持穩定，而甲烷八疊球菌屬的相對豐度也保持穩定; 管網800 m處以后，乙酸含量下降，且微生物代謝過程中使得某些中間產物富集，這對甲烷八疊球菌屬而言，環境開始變得惡劣，這就使得其在該環境下處于不利的地位，競爭能力下降，從而相對豐度下降，廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在該環境下競爭優勢增強，相對豐度增加. 具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。

　　3 結論

　　(1)城市污水管網中生成CH4的量較低，管網中甲烷化程度較低. 在管網初始端沒有CH4的產生，而后隨著管網距離的增加，CH4在管網中呈現出了逐漸增加的變化趨勢.

　　(2)城市污水管網中產甲烷菌主要包含，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬這3種. 產甲烷菌的群落結構在800~1 000 m發生了明顯的改變，在管網該范圍內發生了廣古菌門中的菌屬取代甲烷八疊球菌屬成為第一優勢菌屬的演替過程.

　　(3)城市污水管網中產甲烷菌可利用基質“三甲一乙”中乙酸含量最高，甲胺含量始終維持在極低的水平. 這些物質在管網中均呈現出了先增加后降低的變化趨勢，其中乙酸在600~800 m含量維持穩定. 由于不同產甲烷菌屬適應的物質條件和環境條件不同，因此這些物質條件和環境條件的改變，使得產甲烷菌在管網中的分布發生了改變.（來源及作者：西安建筑科技大學環境與市政工程學院 孫光溪 金鵬康 宋吉娜 王先寶 楊柯瑤）