由于冬季低溫的影響，中國北方污水處理廠常面臨季節性TN超標的問題.此外，受制于市政污水低碳氮比的水質特性，污水處理廠也面臨著異養反硝化不充分而導致的TN超標問題.與異養反硝化相比，硫自養反硝化是以還原態硫為電子供體，NO3--N為電子受體進行的自養反硝化過程，能夠有效地去除水中的NO3--N.硫自養反硝化因無需外加碳源、運行成本低、污泥產量少、效率高、工藝簡單等優點而得到廣泛關注.目前，Li等將硫自養反硝化工藝應用于低溫、低碳氮比條件下污水處理廠氮污染物的去除，并達到了90%以上的氮去除效果.另一方面，硫自養反硝化過程作為冬季或低碳比條件下的脫氮保障工藝，常面臨季節性、間歇性運行的操作方式.但是針對硫自養反硝化工藝饑餓忍耐后能力恢復及其對微生物菌群結構影響的研究卻鮮見報道.

　　近年來，分子生物學作為有效手段用來研究污水處理過程中微生物群落結構特性，如變形梯度凝膠電泳、克隆文庫和高通量測序等. MiSeq高通量測序以Illumina的測序技術為基礎，通過可逆終止試劑方法對數百萬個基因片段同時進行大規模平行測序，具有分析結果精確、高速等特點，被廣泛應用于污水處理過程中微生物結構和多樣性研究.

　　本文以顆粒硫磺和黃鐵礦的硫自養反硝化反應器為研究對象，探究反應器在經過30 d饑餓忍耐后的恢復情況，并利用MiSeq高通量測序對饑餓忍耐前后反應器中細菌群落的變化情況進行分析，以期為污水處理廠脫氮保障工藝的季節性、間歇性運行提供技術參考.

　　1 材料與方法1.1 試驗裝置

　　硫自養反硝化工藝采用降流式生物濾池，試驗裝置示意圖如圖 1所示.反應器為密封的有機玻璃柱，內徑140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容積5.94 L.進水口距柱底600 mm，沿反應器不同高度處分別設置取填料口，取填料口距填料頂部的距離分別是100 mm和300 mm.

圖 1 試驗裝置示意

　　試驗共設2個反應器(分別記為1號、2號)，1號反應器加入硫磺和白云石的混合物，2號反應器加入黃鐵礦和白云石的混合物. 2個反應器中的填料均按1:1的體積比混合裝填，硫磺、黃鐵礦和白云石的粒徑均為5~10 mm.其中，硫磺/白云石的填充區域孔隙率為45.9%，黃鐵礦/白云石為44.1%.

　　1.2 進水水質和接種污泥

　　本試驗用水為人工模擬污水廠尾水，水質指標為: NO3--N濃度為30 mg·L-1，NH4+-N濃度為2 mg·L-1，TP濃度為1 mg·L-1，COD濃度為18~23 mg·L-1，pH為6.8~7.2.接種污泥取自高碑店污水處理廠二沉池回流污泥.

　　1.3 反應器運行方式

　　反應器在低溫下運行85 d (1月2日至3月26日)，主要分為穩定期、饑餓期和恢復期:穩定期(1~30 d)，正常進水，反應器穩定運行，平均溫度為12℃;饑餓期(31~60 d)，停止進水，反應器處于饑餓狀態，平均溫度12.8℃;恢復期(61~85 d)，恢復進水，反應器進入恢復期，平均溫度為14℃.饑餓期結束后及恢復期采集反應器中的污泥樣品(1號饑餓期A1、恢復期A2;2號饑餓期B1、恢復期B2) 進行MiSeq高通量測序分析，分析反應器饑餓期及穩定期細菌群落的變化情況.

　　1.4 測試指標和方法1.4.1 水質指標的測定

　　反應器運行期間，定期采樣進行水質指標的測定，檢測項目包括硝酸鹽氮(NO3--N)、亞硝氮(NO2--N)、總氮(TN)、總磷(TP) 等.其中NO3--N采用紫外分光光度法測定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;TN采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定;TP采用鉬酸鹽分光光度測定.試驗所用分光光度計為HACH DR5000紫外可見分光光度計.生物量采用脂磷法測定.

　　1.4.2 微生物多樣性的測定

　　DNA的提取與PCR的擴增:為了探究系統的細菌群落，在反應的饑餓期和恢復期進行取樣.采用E. Z. N. A. Soil DNA試劑盒(美國Omega公司)，按照試劑盒說明書提供的操作步驟提取.提取的DNA用1%瓊脂凝膠電泳進行檢測. PCR的擴增區域為16S rRNA的V3-V4區，細菌16S rRNA擴增引物采用通用引物(338F/806R).引物名稱和引物序列分別是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT). PCR反應體系: Forward primer (10 μmol·L-1)，2 μL;Reverse primer (10 μmol·L-1)，2 μL;dNTPs (2.5 mmol·L-1)，4 μL;10×PCR buffer，5 μL;Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U·μL-1)，0.3 μL;補充ddH2O至50 μL.反應程序:先95℃預熱5 min;然后進行25個循環(95℃變形30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s)，最后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司) 回收PCR產物，經Tris-HCl洗脫后，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.根據電泳結果.將PCR產物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 進行定量，按照每個樣品的測序量要求，進行相應比例的混合.

　　MiSeq文庫構建與測序:用高通量測序平臺Illumina MiSeq對擴增產物進行MiSeq高通量測序.測序得到的PE reads根據overlap關系進行拼接，同時過濾掉低質量的reads，區別樣品后進行OUT聚類分析和物種分類學分析.

　　生物多樣性和分類學分析:首先將序列按照彼此的相似性歸為操作分類單元(OTU).按照97%相似性進行OUT聚類，采用RDP classifier對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析.利用MOTHUR軟件對樣品覆蓋率(coverage percentage)，ACE，Chao豐富指數以及Shannon多樣性指數進行計算.同時為了保證分析的高可信度，根據SILVA106庫中的參考序列對OUT進行種屬鑒定，種屬比對的可信度閾值設定為80%.

　　2 結果與討論2.1 反應器運行情況

　　穩定期、饑餓期和恢復期的硫自養1號和2號反應器進出水水質的變化情況如圖 2所示.進水NO3--N、NO2--N、TN和TP平均濃度分別為30.00、0.01、35.88和1.00 mg·L-1.穩定期，反應器在低溫下(12℃) 運行30 d后，1號反應器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為1.78、0.03、2.87和0.91 mg·L-1，TN去除率為91.9%，1號反應器具有較高的脫氮效果. 2號反應器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP濃度分別為11.32、0.11、13.10和0.14 mg·L-1，TN和TP去除率分別為63.49%和86.41%. 2號反應器具有同步脫氮除磷的效果.

圖 2 饑餓前后反應器NO3--N、NO2--N、TN、TP的變化

　　反應器穩定運行后，停止進水，進入饑餓期.經過30 d的饑餓忍耐后，反應器在低溫下(14℃) 恢復進水，進入恢復期.由圖 2可以看出，饑餓忍耐后，1號反應器出水NO3--N增加到27.87 mg·L-1，2號反應器出水NO3--N增加到26.56 mg·L-1.但隨著反應器的恢復，出水NO3--N濃度逐漸降低，1號反應器經5 d的恢復(第65 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為0.38 mg·L-1和2.37 mg·L-1，去除率分別為98.8%和93.6%;2號反應器經11 d的恢復(第71 d)，出水NO3--N和TN濃度分別為10.51 mg·L-1和12.91 mg·L-1，去除率為66.40%和65.57%.其次，在恢復期2個反應器的出水NO2--N濃度均呈現先增加后降低的趨勢，恢復初期均出現NO2--N的積累.由圖 2可知，1號反應器恢復期第3 d (第63 d) 出水NO2--N濃度為2.17 mg·L-1;2號反應器恢復期第5 d (第65 d)，出水NO2--N濃度為0.37 mg·L-1.隨著反應器穩定運行，最終1號反應器NO2--N濃度下降到0.1 mg·L-1以下，2號反應器有0.1 mg·L-1 NO2--N的積累量.此外，饑餓忍耐未對2號反應器TP的去除效果產生明顯的影響.原因如下，2號反應器對磷的去除主要是通過黃鐵礦中的鐵與磷結合形成鐵磷沉淀物及鐵的氧化物和氫氧化物對磷有吸附作用，饑餓條件下并未明顯影響這一物理化學過程.結果表明，與1號反應器相比，2號反應器的恢復時間略長，但2個反應器都能在低溫、短期內恢復到正常處理效果.

　　饑餓期(第60 d) 及恢復期(第85 d) 反應器不同高度處微生物量的變化如表 1所示.從中可知，1號和2號反應器饑餓忍耐后不同高度處微生物量均低于恢復期.分析原因，主要是饑餓期間反應器中部分微生物對饑餓環境的忍耐能力差，裂解死亡;部分細菌因營養物質缺乏而進入休眠狀態，不能進行生長繁殖.反應器恢復進水后，生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復，使得微生物量有所增加，同時反硝化性能得以恢復.

　　表 1 饑餓忍耐前后反應器不同高度處生物量的變化/nmol·g

　　2.2 微生物多樣性的分析

　　利用MiSeq平臺對A1、A2、B1、B2這4個污泥樣品進行高通量測序，分別獲得39 989、39 302、45 227、61 572條優化序列.將優化序列截齊后與SILVA106庫比對后進行聚類，在97%的相似性下分別獲得3 188、3 412、1 734、1 976個OUTs.并且4個污泥樣品的覆蓋率(Good's coverage) 均在95%以上，表明本研究中構建的序列庫可以覆蓋細菌群落的多樣性(見表 2).

　　表 2 樣品的物種豐富度和多樣性分析

　　Chao指數和Shannon指數表示微生物群落結構的變化.群落豐富度用Chao指數描述，其值越高表明群落物種的豐富度越高;Shannon指數可以反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性越高. 表 2顯示，4個污泥樣品的Chao和Shannon指數均為A2>A1>B2>B1.結果表明，1號反應器中的物種豐度和多樣性均高于2號反應器.分析原因，主要是黃鐵礦/白云石反應器(2號) 中所用硫源為黃鐵礦，其硫含量低于硫磺.這使得硫磺/白云石反應器(1號) 中的硫自養反硝化菌群因得到充足基質而更好的生長.即由于基質含量的不同，黃鐵礦/白云石反應器中的自養反硝化菌種的生長受到一定的限制.另一方面，經過30 d的饑餓忍耐后，硫磺/白云石和黃鐵礦白云石2個反應器中微生物豐富度和多樣性明顯低于恢復期.分析原因，主要是饑餓期部分微生物對饑餓環境的忍耐能力差，裂解死亡，部分細菌因營養物質缺乏而進入休眠狀態;恢復期生物膜的活性和生長可得到不同程度的恢復.這與上述反應器中微生物量饑餓期低于恢復期的變化是一致的.

　　2.3 群落結構分析

　　基于SILVA數據庫的分類信息，對饑餓期及恢復期污泥樣品的高通量測序數據進行了門、綱、屬水平上的分類分析.門分類水平上，4個污泥樣品共檢測出39個類群，門水平上的大量類群(相對豐度大于1%) 如圖 3所示.從中可知，A1和A2樣品中Proteobacteria為優勢菌群，豐度分別為89.70%和89.77%，其次為Bacteroidetes (5.88%和5.60%) 和Chlamydiae (1.21%和1.71%)，其他菌類比例相對較低(相對豐度小于1%). B1和B2樣品中Proteobacteria為優勢菌群，比例分別為51.82%和55.42%.此外，Bacteroidetes、Chlamydiae、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria、Chlorobi、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes也是B1和B2樣品中主要的門類(相對豐度大于1%).結果表明，1號和2號反應器在生物群落結構和豐度上具有比較明顯的差異.兩組反應器最主要的優勢菌門雖均為Proteobacteria，但其相對豐度存在明顯的差異，且2號反應器在門水平上的主要類群較為多樣.此外，每組反應器饑餓期和穩定期豐度變化不大.

圖 3 門水平上群落結構

　　綱分類水平上，1號和2號反應器中共檢測出68個類群，其中7個類群為主要的綱，如圖 4所示. A1和A2樣品中主要的綱類為β-Proteobacteria，豐度為73.42%和69.15%，且β-Proteobacteria中的一些細菌是與污泥反硝化相關的[20~22];其次為α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Sphinggobacteria、Chlamydiae (相對豐度大于1%). B1和B2樣品中主要的綱類為α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria.此外B1和B2污泥樣品中還含有的δ-Proteobacteria、Ignavibacteria、Chlorobia、Actinobacteria、Anaerolineae、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Phycisphaerae. 圖 4表明，不同樣品中類群結構及豐度差異性較大，1號反應器中β-Proteobacteria的相對豐度高于2號反應器，2號反應器中α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相對豐度則高于1號反應器.

圖 4 綱水平上群落結構

　　屬分類水平上，1號和2號反應器大量類群如圖 5所示.在屬水平上，2個反應器中共檢測出296個細菌類群.其中A1和A2樣品中主要屬類為Sulfobacillus、Variovorax以及Thiobacillus，其豐度分別35.67%、8.82%、19.54%(A1) 和31.98%、13.25%、11.86%(A2).其中，Sulfobacillus是噬酸且耐熱的硫化物礦石氧化菌，也是亞鐵離子氧化菌. Thiobacillus為革蘭氏陰性細菌，是目前被報道最多的用于還原NO3--N的硫氧化細菌，可用于硫自養反硝化處理市政污水和地下水中的NO3--N.此外，A1和A2樣品中的主要類群(相對豐度大于1%) 還包括Thermomonas、Ferruginibacter、Denitratisoma、Sulfurimonas、Rhizobium.

圖 5 屬水平上群落結構

　　與A1和A2樣品相比，B1和B2樣品中的主要類群包括Sulfobacillus、Variovorax、Thiobacillus、Denitratisoma、Ferruginibacter、Neochlamydia、Woodsholea、Blastocatella、Bradyrhizobium、Sulfuritalea等菌屬.并且不同時期反應器中某些菌屬的相對豐度有一定的差別，如B1和B2樣品中Sulfobacillus和Thiobacillus在饑餓期和恢復期的相對豐度分別為0.06%、4.88%(B1) 和3.89%、0.70%(B2)。具體參見污水寶商城資料或http://www.dowater.com更多相關技術文檔。

　　3 結論

　　(1) 顆粒硫磺/白云石和黃鐵礦/白云石反應器經過30 d的饑餓期后，分別需要5 d和11 d就可使NO3--N去除率恢復饑餓前的水平，且恢復期初期均出現NO2--N的積累現象.兩個反應器在短時間內均能恢復穩定運行，在低溫條件仍能保持良好的脫氮效果.

　　(2) 高通量測序結果表明，黃鐵礦/白云石反應器的細菌群落的豐度和多樣性低于硫磺/白云石反應器.經過30 d的饑餓忍耐后，兩個反應器的細菌群落的豐度和多樣性均略低于恢復期.

　　(3) 微生物群落結構的分析表明，顆粒硫磺/白云石和黃鐵礦/白云石硫自養反應器的優勢菌門均為Proteobacteria，主要的綱類均為β-Proteobacteria.顆粒硫磺/白云石反應器中存在起主要反硝化作用的Thiobacillus.