魚(yú)粉是水產(chǎn)動(dòng)物以及畜禽動(dòng)物養(yǎng)殖飼料中無(wú)法替代的優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白源[1]。然而，因加工原料新鮮度不斷下降?腐敗等原因，魚(yú)粉加工在高溫蒸煮和干燥工序過(guò)程中會(huì)釋放出大量的惡臭氣體，潘光等[2]已經(jīng)分析測(cè)定出魚(yú)粉加工惡臭氣體污染成分主要有兩類(lèi)，其中含硫氨基酸產(chǎn)生的終產(chǎn)物H2S是魚(yú)粉加工惡臭氣體的主要成分。H2S氣體是惡臭成分中最為常見(jiàn)而且影響廣泛的氣體，會(huì)引起設(shè)備和管道腐蝕，導(dǎo)致嚴(yán)重的空氣污染，在空氣中容易被氧化成SO2，可對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生酸雨效應(yīng)和毒副作用，H2S氣體還對(duì)人體有毒，低濃度中毒對(duì)人體眼睛和呼吸系統(tǒng)具有強(qiáng)烈的刺激和腐蝕作用，重度中毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)?心臟?肺細(xì)胞損害，出現(xiàn)肺水腫，呼吸?心跳驟停，發(fā)生閃電型死亡。
對(duì)于惡臭氣體的治理主要采用遮蔽法?物理化學(xué)法?生物法等，遮蔽法沒(méi)有完全去除惡臭物質(zhì)，極易造成二次污染，治理成本也比較高;物理化學(xué)法僅能處理成分單一的尾氣，一般設(shè)備比復(fù)雜，能耗高，處理后仍然不能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。生物脫臭技術(shù)[3-15]具有脫臭效率高?沒(méi)有二次污染?設(shè)備簡(jiǎn)單?運(yùn)轉(zhuǎn)成本較低的優(yōu)點(diǎn)。目前為止，國(guó)內(nèi)對(duì)魚(yú)粉加工中有關(guān)含硫臭氣脫除微生物篩選與鑒定的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在篩選獲得高效脫除硫化氫惡臭氣體的菌株，為生物法脫除魚(yú)粉加工惡臭氣體的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 分離源
寧波市象山某魚(yú)粉加工廠的污水沉淀池中的污泥。
1.2 主要培養(yǎng)基
富集培養(yǎng)基:營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(篩選細(xì)菌):蛋白胨10.0，牛肉浸出粉3.0g，氯化鈉5.0g加熱溶于1000mL蒸餾水中，121℃ 滅菌15min，pH 值7.2~7.4;察氏培養(yǎng)基(篩選真菌):硝酸鈉3.0g，磷酸氫二鉀1.0g，硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，蔗糖30.0g加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝115~116℃高壓滅菌30min;自養(yǎng)硫細(xì)菌培養(yǎng)基[A][16](篩選自硫菌):Na2HPO4 3.03g，KH2PO42.0g，Na2CO31g，MgCl0.1g，F(xiàn)eCl30.033g，CaCl20.03g，MnCl20.032g，Na2S2O315.7g，蒸餾水1L，其中Na2S2O3 配成溶液過(guò)濾除菌，滅菌后加入;自養(yǎng)硫細(xì)菌培養(yǎng)基[B][16](篩選自硫菌):Na2S2O35g，K2HPO40.4g，KNO30.4g，NaHCO30.2g，MgSO4 0.12g，NH4Cl0.1g，F(xiàn)eSO4 0.02g，蒸餾水1L，其中Na2S2O3 配成溶液過(guò)濾除菌，滅菌后加入。
分離培養(yǎng)基:各富集培養(yǎng)基加2%瓊脂。
1.3 主要試劑
API50CHB試劑條:購(gòu)自上海梅里埃生物工程有限公司。
AxpPrep細(xì)菌基因組DNA小量制備試劑盒:Axygen，AP-MN-BT-GDNA-50;DNA 凝膠回收試劑盒;TaqDNA聚合酶;DNAmarker均購(gòu)自上海桑尼生物工程有限公司。
1.4 主要儀器
硫化氫分析儀:TY-400-H2S(北京泰亞賽福科技發(fā)展有限責(zé)任公司);光學(xué)顯微鏡:BX51型，(O-lympus公司);掃描電鏡:SU-70型(HITACHI公司)。
2 脫硫微生物的篩選
2.1 高效除硫菌的篩選
2.1.1 脫硫微生物的富集篩選
稱取10g活性污泥樣品，分別接種于裝有100mL滅菌后的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基?察氏液體培養(yǎng)基?自養(yǎng)脫硫細(xì)菌培養(yǎng)基A?自養(yǎng)脫硫細(xì)菌培養(yǎng)基B的250mL三角瓶中，充分搖勻，30℃，150r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)15d，每天往各組培養(yǎng)基中添加Na2S·9H2O(相當(dāng)于200mg/L的H2S)，以淘汰不能利用S2-的微生物。每3d進(jìn)行接種傳代，即每次培養(yǎng)3d后，取10mL原培養(yǎng)液接種到新配置滅菌后的100mL各組培養(yǎng)基中。經(jīng)15d富集培養(yǎng)后，將各組培養(yǎng)液稀釋涂布到對(duì)應(yīng)的平板，30℃倒置培養(yǎng)，平板長(zhǎng)出單菌落后挑選典型單菌落反復(fù)進(jìn)行平板劃線，直至得到單一菌落，接種到對(duì)應(yīng)的斜面上，4℃冷藏備用。
2.1.2 高效脫硫微生物的篩選
初篩:取純化菌株接種于對(duì)應(yīng)類(lèi)型的培養(yǎng)基中，30℃?150r/min振蕩培養(yǎng)24h。取培養(yǎng)菌液按10%接種量加入到含Na2S·9H2O(相當(dāng)于200mg/L的H2S)的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，搖勻，用雙層保鮮膜封口，30℃靜置培養(yǎng)5d，打開(kāi)封口，用感官法初步判定菌株除臭效果。
復(fù)篩:取除臭能力明顯的菌株培養(yǎng)液，按10%接種量加入到含Na2S·9H2O(相當(dāng)于200mg/L的H2S)對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)5d后，用便攜式H2S檢測(cè)儀測(cè)定H2S濃度，每組做8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。選擇脫硫率最高的目的菌株，接種于對(duì)應(yīng)斜面上，4℃冰箱保存。脫硫率為空白組與實(shí)驗(yàn)組的H2S濃度差除以空白組H2S濃度。
2.2 高效除硫菌的鑒定
2.2.1 形態(tài)學(xué)研究
參考伯杰氏手冊(cè)，采用普通光學(xué)顯微鏡?掃描電鏡(SEM)觀察菌株形態(tài)特征，并確定菌體大小。
2.2.2 生理生化特征分析
基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn):運(yùn)動(dòng)性(半固體穿刺法);硝酸鹽還原;產(chǎn)H2S;VP反應(yīng);甲基紅實(shí)驗(yàn);接觸酶實(shí)驗(yàn);氧化酶試驗(yàn);吲哚反應(yīng)。
碳源的利用實(shí)驗(yàn):API50CHB 試劑條，API50CHB試劑條是一種用于研究芽孢桿菌的49種糖發(fā)酵作用的快速測(cè)定試劑條。具體參見(jiàn)污水技術(shù)資料更多相關(guān)技術(shù)文檔。
2.2.3 分子生物學(xué)鑒定
16SrDNA擴(kuò)增引物:采用通用引物，27F5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 5′-CTACG-GCTACCTTGTTACGA-3′。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(50μL):基因組DNA1.0μL，10×Buffer5.0μL，Taq聚合酶1.0μL，dNTP1.0μL，27F引物1.5μL，1492R引物1.5μL，ddH2O39.0μL。反應(yīng)參數(shù)如下:95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s;58℃退火30s;72℃延伸90s;72℃終延伸7min;循環(huán)數(shù)35次。反應(yīng)完成后，取30μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒回收后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBIGenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比較后，判斷菌株種類(lèi)，將其劃分到屬或種。
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