1 引言
雙酚A(Bisphenol A，BPA)是一種具有內分泌干擾性的類雌性激素，被廣泛應用于制造聚碳酸酯、環氧樹脂等高分子材料，也被用在熱穩定劑、增塑劑、橡膠防老劑、阻燃劑和涂料等精細化工產品中.BPA可通過城市污水和工業廢水的排放等途徑進入環境中，污染地表水和地下水.由于BPA可誘導脊椎動物產生前凸反應，導致哺乳動物子代變異效應，且進入人體后會干擾體內正常激素分泌，從而影響人類生殖功能，因此，BPA進入水體后對水生生物和人體健康構成極大的威脅.隨著工農業的快速發展，水體受到BPA污染的形勢更加嚴峻，人們也逐漸認識到凈化水中BPA的重要性和緊迫性.
目前，凈化水中BPA的方法主要有吸附法(Park et al.,2014)、生物降解法(Gassara et al.,2011)，以及光催化、電催化(Zhao et al.,2014)和臭氧氧化(湯茜等，2014)等高級氧化法.生物降解法具有成本低、作用范圍廣及持續時間長等特點，是一種安全有效的降解水中BPA的方法.生物法降解BPA有兩種途徑，一是篩選優勢微生物菌株降解BPA，二是利用菌株分泌的酶對BPA進行降解(Chouhan et al.,2014).相比之下，酶不受微生物代謝抑制劑影響，對環境中營養等條件要求不高，且酶可更高效快速地降解一些特定的污染物(Gassara et al.,2013).因此，采用酶催化技術降解水中的BPA受到越來越多環境領域研究學者的關注.
漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，研究表明其對BPA有較強的催化氧化能力.但是，由于游離漆酶對環境條件十分敏感，如pH、溫度變化等都有可能使其喪失活性，且游離漆酶參與反應后不能回收，難以實現重復利用，限制其在實際中的應用.因此，常采用固定化技術提高酶的穩定性和重復使用性(Homaei et al.,2013).靜電紡絲是一種借助高壓靜電場力使聚合物溶液或熔體快速、高效地形成納米或微米級纖維的方法.靜電紡絲纖維膜具有孔隙率高、比表面積大、均一性好且制備簡單等優點，將其作為固定化酶的載體，有利于酶與底物充分接觸，能有效提高酶的催化效率，且容易從反應體系中分離回收，因此它被人們認為是一種優良的酶固定化基質(Dai et al.,2010b).
本研究采用靜電紡絲纖維膜作為漆酶的固定化載體，利用乳液電紡技術法原位包埋固定化漆酶，對所得載漆酶電紡纖維膜的形貌結構和酶學性能進行表征、分析.同時，利用電紡纖維膜固定化漆酶降解水中BPA，考察不同漆酶濃度、反應溫度及pH值等因素對BPA降解效率的影響，并與游離漆酶進行比較.此外，本文還闡明了電紡纖維膜固定化漆酶的酶活保持及其對水中BPA的降解機理.
2 材料與方法
? 2.1 實驗藥品
實驗所用BPA(分析純，純度98%)，雜色云芝漆酶(EC 1.10.3.2，活性5.43 U · mg-1)及其底物2，2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，純度99%)購自美國Sigma-Aldrich公司.聚乳酸-乙醇酸共聚物(PDLGA，〖(C6H8O4)3(C4H4O4)1〗n)購自濟南岱罡生物工程有限公司，分子量為10萬;嵌段共聚物F108(PEO106-PPO70-PEO106)購自德國BASF公司.實驗所用超純水電阻率≥18.2 MΩ · cm，來自美國Millipore Simplicity 185超純水系統.其他藥品均為分析純，購自國藥集團化學試劑北京公司.
2.2 實驗裝置
靜電紡絲的實驗裝置外殼材質為有機玻璃，內部組件由高壓直流電源(HB-Z503-2AC，天津市恒博高壓電源廠)、雙通道微量注射泵(TJ-3A/W0109-1B，保定蘭格恒流泵有限公司)、噴絲頭和接收板組成.本實驗裝置的噴絲頭采用的是帶針頭(內徑為0.5 mm)的鎖緊頭微量進樣器(上海高鴿工貿有限公司)，接收板為帶升降功能的普通鐵板，可調距離為0~25 cm.該設備中噴絲、接收、中間控制裝置均可調、可換，且可控制實驗條件如溫度(10~60 ℃)、濕度(20%~80%)、電壓(0~50 kV)等.
2.3 實驗過程
2.3.1 電紡纖維膜固定化漆酶的制備
將1 g聚合物加入盛有7 g二氯甲烷和1 g N-N二甲基甲酰胺溶液的玻璃錐形瓶中，然后再加入0.15 g嵌段共聚物F108作為乳化劑，混合后置于磁力攪拌器上在室溫條件下攪拌3 h得到混合溶膠.稱取一定質量的漆酶溶于pH=4.0的磷酸鹽緩沖溶液中，振蕩至全部溶解.取250 μL一定濃度的酶溶液(1.0~10.0 mg · mL-1)加入上述混合溶膠中，在旋渦混合器上混合20 min直至形成均質乳液.然后將乳液引入靜電紡絲裝置的微量進樣器中待紡.調節注射泵，設定紡絲液的流速為1.5 mL · h-1，調節升降板，設定極板間距為15 cm，調節紡絲電壓為10 kV，獲得穩定連續的噴射流，在覆蓋有鋁箔紙的接收板上收集纖維產品.5~6 h后待纖維膜厚度達到0.8~1 mm，停止紡絲，即得到載漆酶電紡纖維膜.紡絲過程控制溫度為25±1 ℃，濕度為40%左右.為了觀察漆酶在電紡纖維膜中的分布形態，采用相同濃度的異硫氰酸熒光素(FITC)標記漆酶代替上述實驗中的酶液制備電紡纖維膜固定化漆酶樣品.作為吸附對照實驗，采用滅活后的漆酶溶液(煮沸10 min)代替上述酶液制備滅活的電紡纖維膜固定化漆酶樣品.
2.3.2 纖維膜的表征
采用場發射掃描電子顯微鏡(FESEM S-4800，HITACHI，日本)觀察載漆酶電紡纖維膜的表面形貌，并從10張掃描電鏡(SEM)圖片中任選100條纖維計算電紡纖維的平均直徑.采用全自動比表面積分析儀(Micromeritics ASAP 2020，美國)測量電紡纖維膜的比表面積和孔隙體積.為了觀察漆酶在纖維中的分布情況，采用FITC標記漆酶制備電紡纖維膜固定化漆酶樣品，并用激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM，LSM510，ZEISS，德國)觀察標記漆酶在纖維中的分布情況，其激發波長和發射波長分別為488 nm和535 nm.
2.3.3 漆酶活性測定
以磷酸鹽緩沖溶液(pH=4.0)配制濃度為0.5 mmol · L-1的ABTS溶液為底物，采用紫外-可見分光光度計(Cary 50，瓦里安儀器公司，美國)記錄催化反應5 min時在420 nm處的吸光度值，然后根據酶活力定義計算漆酶酶活.一個酶活力單位定義為每min氧化1 μmol底物所需要的酶量.具體的酶活性和酶固定化率測量與計算方法參照文獻(Dai et al.,2010a).
2.3.4 BPA降解實驗
量取30 mL一定濃度的BPA水溶液(pH=7.0，0.5~50 mg · L-1)于玻璃錐形瓶中，向其中加入8片載漆酶電紡纖維膜(1 cm× 1 cm，總重量130~150 mg)，然后置于搖床在避光條件下振蕩(30 ℃，140 r · min-1)反應5 h.作為對照，本實驗采用等量的游離漆酶和滅活的電紡纖維膜固定化漆酶于相同條件下反應.每次取樣時向樣品中加入50 μL 疊氮化鈉(20 mmol · L-1)以終止反應.所有實驗均設3個平行樣.在每個取樣時間點取1.0 mL溶液用高效液相色譜(HPLC Agilent 1260，美國)分析其中的BPA含量.同時，制備含有不同酶量的電紡纖維膜固定化漆酶樣品，考察不同漆酶濃度對BPA的降解規律.為探討溶液pH值對漆酶降解水中BPA的影響，采用不同pH值(2.0~9.0)初始濃度為10 mg · L-1的BPA溶液在30 ℃條件下進行降解實驗;設定溶液pH為7.0，考察不同反應溫度(10~50 ℃)下游離漆酶和固定化漆酶對BPA的降解效率.
3 結果與討論
3.1 電紡纖維膜的形貌表征
從圖 1a中看出，所得纖維絲較均勻，且排列良好，平均直徑約為(650±30)nm，纖維絲中幾乎沒有珠泡，纖維表面有許多直徑約為幾十nm的孔結構.表 1中孔體積的測定結果(0.0169 cm3 · g-1)也表明纖維表面多孔結構的存在.這些纖維多孔結構是在靜電紡絲的相分離過程中形成的.在高壓靜電的作用下，紡絲液中的聚合物可能分布不均勻，容易形成聚合物富集區域(polymer-rich)和聚合物貧乏區域(polymer-poor).在溶劑揮發的過程中，由于聚合物富集區域和聚合物貧乏區域發生相分離，在聚合物貧乏區域更容易形成孔結構(Huang et al.,2003).此外，靜電紡絲參數也可能會影響孔結構的形成.這些多孔結構可以增加纖維膜的比表面積，可以為吸附質提供更多的吸附空間，也可以為酶與底物的接觸反應提供通道(Niu et al.,2013).
?圖 1 電紡纖維膜固定化漆酶的SEM(a)和LCSM(b)圖片
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表 1 載漆酶電紡纖維膜的形貌表征結果和酶活性效率
由于從SEM圖片中不能確定漆酶是否存在或以何種形式分布于電紡纖維膜中，因此本研究采用激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM)觀察FITC標記漆酶在電紡纖維膜中的分布形態，如圖 1b所示.從圖中可以看出，纖維絲發出綠色熒光，證明漆酶被成功包埋于纖維內部，酶固定化率達到80%;且漆酶在纖維中分布均勻，也表明載漆酶電紡纖維呈現出殼-核結構.在油包水乳液電紡過程中，乳液液滴在電場力作用下迅速向垂直方向運動以實現往軸中心區域富集，被拉伸成橢圓形狀.由于乳液中的油相(聚合物溶液)中的二氯甲烷揮發速度比水快，纖維外層的粘度迅速增加.正是這種粘度差異使得橢圓液滴向纖維內部運動，然后被包埋在纖維中，形成殼-核結構的纖維(Dai et al.,2010a; Yang et al.,2008).
此外，因為本研究中所用聚合物具有良好的生物相容性，形成的纖維外殼可以為包埋在纖維內部的漆酶提供穩定的環境，使漆酶少受外界不良因素的干擾;同時纖維表面的多孔結構可以為底物提供通道，便于漆酶與底物的反應，因此漆酶得以保持較高的酶活性(最優為79.8%).
3.2 BPA的降解效率
3.2.1 漆酶濃度影響
漆酶能催化氧化多種酚類化合物，在治理含酚廢水方面有著很大的應用前景(Asadgol，et al.，2014).但高質量的工業化漆酶來源仍然較少，導致漆酶價格偏高.本實驗通過探究不同濃度的游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶對BPA的降解效率，確定實驗中最佳的漆酶用量，控制成本.
從圖 2中可知，隨著漆酶濃度的升高，游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶對BPA的降解效率都呈現上升趨勢.當實驗中使用滅活的電紡纖維膜固定化漆酶(即漆酶濃度為0 U · mL-1)時，電紡纖維膜對水中BPA有一定的吸附作用，吸附效率可達25%左右，這主要歸功于纖維膜較大的比表面積和豐富的多孔結構(如表 1和圖 1所示).當溶液中漆酶溶液較低時(0.036 U · mL-1)，5 h后游離漆酶和固定化漆酶對BPA 的降解率差別不明顯.但隨著漆酶濃度增加，固定化漆酶對BPA的降解效率較游離酶低，當漆酶濃度增加到0.36 U · mL-1時，游離漆酶對BPA的降解率接近100%，而固定化漆酶對BPA的降解率為80%左右.電紡纖維膜固定化漆酶的酶活性效率為72.5%~79.8%，當固定化過程中使用的漆酶濃度過高時，酶活性效率反而降低.這主要是由于高濃度漆酶溶液使得紡絲溶液的性質發生變化，導致部分漆酶可能無法被包埋進纖維中，在紡絲過程中已造成部分漆酶活性損失.綜合以上因素考慮，實驗選定最優漆酶濃度為0.18 U · mL-1.
?圖 2 不同濃度游離漆酶(a)和電紡纖維膜固定化漆酶(b)對BPA的降解效率
3.2.2 BPA濃度影響
漆酶對不同濃度BPA的降解效率隨時間變化趨勢如圖 3所示.從圖中可以看出，游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶對不同濃度的BPA的降解效率均隨時間遞增，但隨BPA的濃度增加而降低.在5 h的反應時間內，游離漆酶對中低濃度BPA溶液的降解效率要高于固定化漆酶.游離漆酶在5 h內幾乎完全降解低濃度的BPA溶液(0.5 mg · L-1和1 mg · L-1)，而固定化酶的降解效率在75%左右.一方面，這是由于固定化過程會對酶活不可避免地造成一定的損失;另一方面酶固定化后與反應物的接觸機率比游離酶小，且對底物的親和力也比游離酶低.本研究結合漆酶降解水中BPA的反應初始濃度和速率，利用Hanes-Woolf圖得到動力學參數，然后計算出游離漆酶和固定化漆酶的米氏常數(Km)分別為0.015 mmol · L-1和0.114 mmol · L-1，表明經過纖維膜固定化后，漆酶對水中BPA的親和力降低.因此，固定化酶在相同時間內對BPA的降解效率低于游離酶.盡管酶被包埋固定在纖維中后與反應物的接觸機率減小，但得益于電紡纖維膜對水中BPA的吸附作用(吸附效率為25%左右)，使電紡纖維膜固定化漆酶對低濃度BPA的降解效率仍高于70%.然而，對于高濃度的BPA溶液(50 mg · L-1)，游離酶及固定化酶的降解效率均可達到60%以上，表明在高濃度底物條件下，固定化漆酶與底物接觸機率不佳的問題也可以被部分克服.
?圖 3 游離漆酶(a)和電紡纖維膜固定化漆酶(b)對不同濃度BPA的降解效率
3.2.3 pH值影響
不同來源的漆酶，最適pH值也不同，漆酶的活性受pH值影響很大(鈔亞鵬和錢世鈞，2001).本文考察了溶液pH值對游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶降解水中BPA的影響，結果如圖 4所示.從圖中可以看出，電紡纖維膜固定化漆酶受溶液pH值影響較小，在pH值4.0~9.0范圍內均能保持較高的活性，而游離漆酶則受pH值影響相當明顯.當pH值為5.0時，游離漆酶對BPA的降解效率最高，達到90%左右.但是，當溶液pH值過高(> 9.0)或者過低(<2.0)時，游離漆酶幾乎完全失去活性，對BPA的降解效率均低于5%，而電紡纖維膜固定化漆酶仍然能降解56%以上的BPA.結果表明電紡纖維膜固定化漆酶對pH變化的耐受性要遠遠強于游離酶，可以在更廣泛的pH值范圍內高效降解水中的BPA.這主要是因為通過乳液電紡技術可以將漆酶原位包埋固定在纖維內部，纖維的聚合物外殼(聚乳酸-乙醇酸共聚物)具有良好的生物相容性，對漆酶的活性結構影響較小，且它可以成為漆酶分子與酸性溶液(pH=2.0)或堿性溶液(pH=9.0)接觸的緩沖區，保護漆酶的分子結構，減少外界酸堿環境變化對漆酶活性的影響.
?圖 4 不同pH條件下游離漆酶(a)和電紡纖維膜固定化漆酶(b)對BPA的降解效率
3.2.4 溫度影響
由于溫度對漆酶的活性也有較大影響，因此本文比較了5個溫度梯度(10~50 ℃)下漆酶對BPA溶液的降解效率.從圖 5中可以看出，隨著溫度的升高，游離漆酶和電紡纖維膜固定化漆酶對BPA的降解效率都有所提高.本研究選用的游離漆酶對高溫的耐受性較好，但對低溫的耐受性略差.在較低的溫度下，漆酶活性受到抑制.當溫度為10 ℃時，5 h內游離酶對BPA的降解率為79%，固定化酶的降解率也可達74%.此外，固定化酶對BPA的降解率隨溫度變化波動較小，游離酶則變化較大.漆酶固定化后受溫度影響比游離漆酶小，表明漆酶經固定化后其穩定性得到了提高.固定化漆酶對溫度變化耐受性的提高也是歸功于漆酶被包埋在纖維內部，纖維的聚合物外殼結構可以保護漆酶，減少外界溫度條件變化對漆酶活性的影響.
?圖 5 不同溫度下游離漆酶(a)和電紡纖維膜固定化漆酶(b)對BPA的降解效率
4 結論
1)采用乳液靜電紡絲技術可以將漆酶成功包埋固定于纖維內部，且歸功于聚合物纖維外殼的保護與纖維表面多孔結構提供的反應通道，電紡纖維膜固定化漆酶能保留79.8%的酶催化活性.
2)綜合考慮污染物去除效率和成本，實驗選定最優漆酶濃度為0.18 U · mL-1;在該漆酶濃度條件下，電紡纖維膜固定化漆酶對水中不同濃度BPA均有較高的降解效率.具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。
3)隨著溶液pH值和溫度的變化，游離漆酶對水中BPA的降解效率變化較大，而電紡纖維膜固定化漆酶對BPA降解效率的波動明顯較小，表明漆酶經靜電紡絲電紡纖維膜固定化后對pH值和溫度等環境因素變化的耐受性明顯增強，穩定性得到提高.
