1 引言

　　生物法污水處理是被國內外廣泛應用的技術，此方法具有處理徹底、有機物降解率高、二次污染小、能耗低和運行管理方便等優點，但由于水溫影響到微生物的生長和繁殖，使得溫度成為生物污水處理效率的限制因子(Namsivayam et al., 2011;Jin et al., 2005).我國絕大部分被污染的海洋、湖泊冬季平均溫度多在4 ℃以下，因此在生物污水處理中溫度是影響生物污水處理效果的一個重要因素.

　　低溫微生物指生活在低溫環境下的微生物.這類微生物可分為兩類.一類是必須生活在低溫條件下，在0 ℃可生長繁殖，最適溫度不超過15 ℃，最高溫度不超過20 ℃的微生物，稱之為嗜冷菌(Psychrophiles);另一類是能在低溫條件下生長，在0～5 ℃可生長繁殖，最高生長溫度可達20 ℃以上的微生物稱之為耐冷菌(Psychrotrophs)(辛秀明，1998;Whyte et al., 1996).

　　污水處理效率通常用污水中有機物的去除率表示，而化學需氧量(COD)是衡量水中有機物質含量多少的指標，其值越大，說明水體受有機物的污染越嚴重，因此，通常可以用 COD 的去除率表示污水處理效率的高低(Wu et al., 2011).污水生化處理的實質是微生物所產生的多種酶催化一系列生物氧化還原反應從而達到去除污水中有機物的目的.脫氫酶(DHA)能使被氧化的有機物氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，因而其活性能反映處理工藝中活性微生物量及其對有機物的代謝能力(Yang et al., 2002).低溫菌的冷適應機制之一是其體內參與代謝的酶在低溫下仍具有高效催化活性.近年來，關于常溫條件下COD的去除率與微生物的脫氫酶活性相互關系的研究很多(Park and Lee， 2005)，而有關5 ℃以下的低溫環境的研究卻很少，因此，尋找一株在低溫和常溫環境下同時具有高效降解性的耐冷菌對污水處理具有重大意義.本項研究從低溫活性污泥中分離出適合低溫污水處理的高效耐冷菌，將該菌進行分類鑒定，并通過對比該菌株在低溫(4 ℃)和常溫(25 ℃)條件下對污水中COD的去除率以及體系DHA活性，表明該菌株對低溫環境條件下的污水處理具有潛在的應用價值

　　2 材料與方法

　　2.1 樣品采集

　　活性污泥取自青島李村河污水處理廠曝氣池.

　　2.2 模擬生活污水

　　COD為800 mg · L-1的模擬生活污水(崔麗等，2007)：葡萄糖 0.1700 g，可溶性淀粉 0.1600 g，CH3COONa 0.2330 g，NH4Cl 0.0255 g，蛋白胨 0.1580 g，牛肉膏 0.0600 g，(NH4)2SO4 0.028 4 g，KH2PO4 0.0700 g，Na2CO3 0.0600 g，pH 5.5~6.0，去離子水1.0 L.

　　COD為400 mg · L-1的模擬生活污水：葡萄糖 0.0850 g，可溶性淀粉 0.0800 g，CH3COONa 0.1165 g，NH4Cl 0.0255 g，蛋白胨 0.0790 g，牛肉膏 0.0300 g，(NH4)2SO4 0.0284 g，KH2PO4 0.0700 g，Na2CO3 0.0600 g，pH 5.5~6.0，去離子水1.0 L.

　　2.3 主要儀器與試劑

　　電泳儀、PCR儀購自Bio-RAD公司，紫外可見分光光度計購自島津公司，臺式冷凍振蕩器購自太倉華利達實驗設備有限公司.

　　Taq聚合酶、pMD19-T載體、DNA Marker、T4連接酶、PCR產物純化試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司，引物合成和DNA測序由南京金斯瑞生物技術有限公司完成，其他試劑為國產分析純.

　　2.4 高效耐冷菌的篩選

　　將50 mL活性污泥樣品放入滅菌后的裝有小玻璃珠的250 mL錐形瓶內，加入50 mL無菌水，30 ℃100 r · min-1搖床振蕩1 h，使活性污泥里的微生物充分釋放出來.采用稀釋涂布平板法，將處理后的活性污泥制成10-3、10-4、10-5三個濃度梯度的活性污泥稀釋液，涂布到LB培養基上，4 ℃培養5~7 d，挑取具明顯生長優勢且形態、色澤不同的大型菌落，進行平板劃線純化，反復進行3次，同時用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養.

　　將種子液按7%的接種量接入模擬生活污水(接種之前要將種子液離心，棄上清，后用等體積的無菌水重懸、離心、棄上清以洗去殘留的LB液體培養基，重復洗3次即可，下同)，4 ℃搖床培養，150 r · min-1下培養96 h，裝液量為每100 mL/250 mL三角瓶;發酵液經5000 r · min-1，25 min離心取上清液測定COD，計算COD的去除率，同時測定體系DHA活性.

　　2.5 高效耐冷菌的鑒定

　　參照文獻對菌株進行形態觀察和生理生化試驗(東秀珠和蔡妙英，2001).另外對菌株進行16S rDNA鑒定，具體方法如下.直接用菌體作為模版，選用16S rDNA通用引物27f：(5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)1492r：(5′-GGTTACCTTGTTACGAC TT-3′)，擴增體系(25 μL)：10×Taq buffer2.5 μL，Mg2+(25 mmol · l-1)2.0 μL，dNTP(2.5 mmol · l-1)2.0 μL，引物(25 pmol · μL -1)各0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，ddH2O 17.2 μL.反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環30次，72 ℃終末延伸10 min，10 ℃保溫10 min.

　　PCR產物經回收試劑盒純化，然后進行T-A克隆，挑取陽性克隆子送南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序.測序結果提交NCBI 數據庫中進行序列比對分析(Genbank序列登陸號KJ125513)，選取同源性較高的序列，利用MEGA5.2軟件，基于鄰接法(Neighbor Joining method)構建菌株系統發育進化樹.

　　2.6 不同因素對高效耐冷菌處理污水的影響

　　2.6.1 運行時間對COD去除率的影響

　　裝液量為100 mL污水/250 mL三角瓶，投加耐冷菌后分別于4 ℃、25 ℃、150 r · min-1振蕩處理96 h，每隔12 h取1次樣，培養物經5000 r · min-1，25 min離心取上清液測定COD，計算其在低溫、常溫下COD的去除率.

　　2.6.2 初始COD對COD去除率及體系DHA活性影響

　　7%的接種量將耐冷菌接種到初始COD分別為400 mg · L-1、800 mg · L-1的模擬生活污水中，分別于4 ℃、25 ℃搖床培養96 h，計算其在低溫、常溫下COD的去除率及DHA活性.

　　2.6.3 接種量對COD去除率及體系DHA活性影響

　　分別以3%、5%、7%、10%的比例投加耐冷菌，分別于4 ℃、25 ℃搖床培養96 h，計算其在低溫、常溫下COD的去除率及DHA活性.

　　2.6.4 初始pH對COD去除率及體系DHA活性影響

　　使用1 mol · L-1的H2SO4和1 mol · L-1的NaOH將模擬污水pH值分別調為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，投加耐冷菌后分別于4 ℃、25 ℃搖床培養96 h，計算其在低溫、常溫下COD的去除率及DHA活性.

　　2.7 測定項目及分析方法

　　COD：重鉻酸鉀法;DHA活性：氯化三苯基四氮唑(TTC)比色法(齊魯青等，2012; Li et al., 2012);測定溫度為污水降解溫度;實驗進行3次重復，每次取3個重復樣，實驗數據取3個重復樣的平均值，并進行標準差分析(圖 3～圖 6中誤差線表示標準差).單因素和多因素方差分析(ANOVA)在SPSS16.0完成.

　　3 結果

　　3.1 高效耐冷菌的篩選

　　4 ℃條件下，從LB培養基分離到5株菌落形態大、生長速度快的耐冷菌，依次命名為DW1～DW5.

　　模擬污水實驗結果表明，5株菌在低溫時對COD的去除率在30.4%～67.7%之間，其中菌株DW1的脫氫酶活性(以TF計，下同)和COD的去除率最高，其余的4株細菌的去除率都低于55.0%(表 1).由此可見菌株DW1對污水中COD的去除效果較好，因此選擇菌株DW1作為研究對象，用于后續研究.

表1 耐冷菌對COD的去除率及其脫氫酶活性

　　3.2 菌株DW1的鑒定

　　菌株DW1在LB培養基上的菌落及菌體形態見圖 1.菌株DW1菌落呈淺粉紅色，圓形、濕潤，邊緣整齊.

?圖 1 DW1的菌落形態(a)以及光鏡下的菌體形態(b)

　　通過對菌株DW1進行16S rDNA擴增、克隆測序后得到大小為1498 bp的序列，系統發育樹結果顯示(見圖 2)DW1與Pseudomonas gessardii (NR_024928.1)聚于同一個分支上，序列相似性達99%，結合形態觀察和生理生化特性(表 2)，DW1初步鑒定為Pseudomonas sp..

?圖 2 基于16S rDNA序列菌株DW1的系統發育進化樹?

?表2 菌株DW1部分生理生化特性

　　3.3 菌株DW1處理模擬污水的影響因素

　　3.3.1 運行時間對COD去除率的影響

　　低溫條件下，菌株DW1對污水中COD的去除率隨著運行時間的延長增加(圖 3)，運行60 h后，COD的去除率趨于穩定，達到67%;常溫條件下，菌株DW1對污水中COD的去除率先迅速升高，運行24 h去除率達到最大值73%，后出現小幅下降，最后趨于穩定.通過菌株DW1在低溫和常溫對污水中COD去除率的比較，運行36 h內，菌株DW1在常溫對污水中COD的去除率明顯高于低溫;36 h后兩者趨于穩定，且在常溫對污水中COD的去除率略高于低溫.

?圖 3 運行時間對COD去除率的影響?

　　3.3.2 初始COD對COD去除率及體系DHA活性影響

　　菌株DW1對初始 COD 高濃度污水COD的去除率較高，COD的去除率與DHA活性正相關(圖 4).在低溫和常溫條件下，去除率分別為69.8%和76.2%; 同樣高濃度污水DHA酶活性也較高，在低溫和常溫分別為9.89 μg · mL-1 · h-1和12.13 μg · mL-1 · h-1. 因此，本研究中菌株DW1較適合初始 COD 負荷較高的污水處理.

?圖 4 初始COD對COD去除率及DHA活性的影響(注：不同小寫字母表示同一溫度下不同處理的COD去除率的差異顯著(p<0.05)，不同大寫字母表示同一溫度下不同處理的COD去除率的差異極顯著(p<0.01)，下同)?

　　3.3.3 接種量對COD去除率及體系DHA活性影響

　　低溫時，污水中COD去除率在65%左右，其中接種量為7%時最高，為69.9%(圖 5)，同時DHA活性介于6.5～11.0 μg · mL-1 · h-1之間，接種量為3%時，DHA活性最高，接種量為5%、7%時次之，接種量為10%時，DHA活性最低.常溫時，污水中COD去除率在75%左右，維持在較高水平，DHA活性介于8.3～15.2 μg · mL-1 · h-1之間，接種量為3%時，DHA活性最高，接種量為5%、7%時次之，接種量為10%時，DHA活性最低.

　　菌株DW1在接種量為7%時，COD的去除率最高，而接種量為3%時，DHA活性最高.推測原因為接種量為3%時，運行96 h細菌仍然處于對數期，DHA活性最高，但是由于細菌未達到最大生長量，因此，COD去除率并未達到最高;接種量為5%時，運行96 h細菌處于穩定期，此時COD去除率達到最大.接種量為10%時，運行96 h細菌處于衰亡期，因此，DHA活性和COD去除率均處于最低狀態.

?圖 5 接種量對COD去除率及DHA活性的影響?

　　3.3.4 初始pH對COD去除率及體系DHA活性影響

　　如圖，pH對菌株的降解效能有明顯的影響.低溫時，污水pH值為7.0時，污水中COD去除率以及DHA活性最高，分別為71.2%、11.35 μg · mL-1 · h-1，pH為6.0、8.0時，COD去除率以及DHA活性次之，pH為5.0、9.0時，體系中COD去除率和DHA活性明顯降低，污水處理效果最差(圖 6).常溫時，污水中COD去除率和DHA活性的變化趨勢與低溫相同，pH為7.0時，COD去除率和DHA活性最高，分別為78.8%和15.11 μg · mL-1 · h-1;可見菌株DW1較適合初始pH為7.0的污水處理.

圖 6 不同初始pH對COD去除率及DHA活性的影響

　　4 討論

　　目前純培養微生物在低溫條件下對含有多種碳源的模擬污水COD的去除率都較低.姜安璽等(2002)采用耐冷復合菌群處理低溫生活污水，CODMn由單一菌群35%的去除率提高到復合菌群89%.徐成斌等(2014)分離得到一株以柴油為碳源的降解菌株Q21，該菌在15 ℃條件下運行72 h時對柴油的降解率為71.5%.單一菌株對COD的去除率往往比混合菌群的低，原因是溫度在很大程度上影響著微生物的生理活動，對微生物個體的生長、繁殖、新陳代謝及種群分布和種群數量起著決定作用，從而影響了整個污水處理效率.混合菌群中微生物的種類較多，不同的微生物最適的碳源不同，因此在處理含有多種碳源的模擬污水時COD的去除率相對較高.本研究篩選出的菌株DW1在4 ℃條件下對含有多種碳源的模擬污水COD的去除率高達67.7%，同時，該菌在4 ℃和25 ℃條件下均具有較高的脫氫酶活性.

　　假單胞菌對低溫污水中的有機物具有高效降解率.賁岳等(2008)從4 ℃生活污水處理系統中篩選出 6 株耐冷菌，該混合菌群對中、低溫污水COD 的去除率可分別達到 80.9%和73.4%，其中一株為假單胞菌;徐巧等(2010)從土壤中篩選出一株高效耐冷菌黃假單胞菌，該菌株在5 ℃下對以葡萄糖為唯一碳源的模擬污水COD的去除率在90%以上.

　　如圖 3所示菌株DW1在低溫時COD去除率隨著時間的增加而增加，96 h達到最高67%;但是在常溫時COD去除率在培養 24 h 達到最高，73%，在36 h時略有下降，推測可能是運行36h時，菌種微生物發生了自溶現象，導致 COD去除率有所降低.隨后，菌株DW1對COD去除率達到穩定狀態.導致菌株DW1菌體自溶的原因可能有以下兩個(李雪芝等，2005)：①隨著時間的推移菌株本身對廢水污染物的降解能力變得較差，而時間的延長會致使吸附到菌體上的物質脫吸，或由于不適應環境而死亡的菌體自溶或菌株的分泌物所致;②微生物對碳源不斷利用，某種碳源的消失會導致微生物的不適應，出現部分菌體自溶，隨著微生物逐漸適應環境，COD去除率也開始升高.

　　培養時間是影響COD去除率的重要影響因子.周圍等(2012)分離篩選到一株具有高效降解苯環化合物的菌株PM8，30 ℃條件下，菌株PM8在36 h時對酒廠廢水CODCr去除率較低(<55%)，72 h時菌株PM8對酒廠廢水COD去除率為83.68%，接近于國家對污水排放的三級排放標準;黃華(2012)通過馴化培養得到降解黃藥生產廢水的混合細菌，該混合降解菌在30 ℃時對配制丁基黃藥模擬廢水、0#柴油、藥劑廠黃藥車間廢水中CODCr去除率隨著時間延長而增加，80 h時對配制丁基黃藥模擬廢水、0#柴油CODCr去除率分別是70%、35%，10 d后對藥劑廠黃藥車間廢水中CODcr去除率為78%.本實驗分離到的菌株DW1在低溫和常溫條件下，對COD為800 mg · L-1的多種碳源模擬污水COD去除率分別達到67%、73%，去除效果明顯好于國內報道的COD降解菌株.

　　菌株DW1適合初始 COD 負荷較高的污水處理.原因可能是當進水中COD濃度較高時，污水處理系統中的營養水平會直接影響微生物的代謝，營養水平較高時，能保證微生物正常增殖使生物量增多，高的生物量進而使DHA活性更高，對有機物的降解率增大(Li et al., 2007).因此，菌株DW1對高濃度有機污水具有一定的應用前景.同時，COD的去除率與DHA活性正相關，原因是廢水生化處理的實質是微生物所產生的多種酶催化一系列生物氧化還原反應從而達到去除污水中有機物的目的，其中，DHA能使被氧化的有機物氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，因而其活性能反映處理工藝中活性微生物量及其對有機物的代謝能力(Margesin and Schinner， 1997).具體參見 污水處理技術資料或污水技術資料更多相關技術文檔。

　　該菌株適合處理中性污水.pH影響COD 的去除率主要是因為pH的改變影響了DHA的活性，而pH影響酶活力的原因可能有以下幾個方面：過酸或過堿可以使酶的空間結構破壞，引起酶構象的改變，酶活性的喪失;當pH改變不很劇烈時，酶雖未變性，但活力受到影響;pH能夠影響維持酶分子空間結構的有關基團解離，從而影響酶活性部位的構象，進而影響酶的活性(Dutta and Banecrjee， 2006).